基于腸道菌群和代謝組學(xué)研究化滯柔肝顆粒治療非酒精性脂肪肝的作用機(jī)制

朱春勝，施亞敏，付智慧，于東升，邊 猛，聶安政，李曉萍

基于腸道菌群和代謝組學(xué)研究化滯柔肝顆粒治療非酒精性脂肪肝的作用機(jī)制

朱春勝，施亞敏，付智慧，于東升，邊 猛，聶安政，李曉萍*

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052

探討化滯柔肝顆粒治療非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的作用機(jī)制。高脂飲食飼養(yǎng)8周構(gòu)建大鼠NAFLD模型，化滯柔肝顆粒ig給藥4周。半自動(dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠血脂相關(guān)指標(biāo)；油紅O染色觀察肝臟組織病理變化；Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)V3～V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）開(kāi)展血漿代謝組學(xué)研究，并結(jié)合Spearman進(jìn)行腸道菌群與代謝組學(xué)之間的關(guān)聯(lián)分析。與模型組相比，化滯柔肝顆粒中、高劑量組可顯著降低大鼠體質(zhì)量（＜0.05、0.01）和血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）水平（＜0.01），升高高密度脂蛋白（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平（＜0.05、0.01）。此外，化滯柔肝顆粒高劑量組還可顯著降低大鼠低密度脂蛋白（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平（＜0.05）。油紅O染色顯示各給藥組脂滴分布較模型組減少。16S rDNA測(cè)序顯示化滯柔肝顆粒可提高NAFLD模型大鼠杜氏乳桿菌屬、脫硫弧菌屬、Ruminococcaceae-UCG-010等菌群的相對(duì)豐度。代謝組學(xué)共篩選出18個(gè)差異代謝物，通路分析顯示化滯柔肝顆粒抗NAFLD主要通過(guò)調(diào)控氨酰-tRNA生物合成、膽汁分泌、膽固醇代謝等通路。化滯柔肝顆粒改善NAFLD的作用機(jī)制可能與調(diào)控腸道菌群組成和膽汁分泌、膽固醇代謝等相關(guān)代謝通路有關(guān)。

化滯柔肝顆粒；非酒精性脂肪肝；腸道菌群；代謝組學(xué)；膽固醇代謝

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是世界范圍內(nèi)較常見(jiàn)的慢性肝病，尤其是在西方國(guó)家，其正成為肝移植最常見(jiàn)的適應(yīng)證[1]。NAFLD包含一系列的組織學(xué)特征，臨床以肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)度堆積為特征的單純性脂肪變性，到炎癥或纖維化相關(guān)的非酒精性脂肪性肝炎，最終發(fā)展為肝硬化和肝臟惡性腫瘤[2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示NAFLD的全球患病率已高達(dá)25%，其中NAFLD影響了大約27%亞洲人口，30%美國(guó)人口，30%南美人口，24%歐洲人口，以及13%非洲人口[3-5]。值得注意的是，目前NAFLD已成我國(guó)第一大慢性肝病，NAFLD在成人中的患病率已高達(dá)29.2%，且逐漸呈現(xiàn)出年輕化趨勢(shì)[6-7]。此外，大量臨床研究顯示NAFLD不僅與2型糖尿病、慢性腎臟疾病及心血管疾病有著密切聯(lián)系，而且還是肝臟惡性腫瘤的主要危險(xiǎn)因素[8-9]。可見(jiàn)，NAFLD危害嚴(yán)重，需引起進(jìn)一步的重視。

目前，NAFLD的一些治療方法已在臨床試驗(yàn)中被證實(shí)具有較好的療效，如臨床中常采用的吡格列酮、維生素E、多烯磷脂酰膽堿等藥物治療[10-11]。然而，上述藥物在臨床使用過(guò)程中存在部分不良反應(yīng)，如服用吡格列酮可使患者體質(zhì)量增加3～5 kg，此外還有增加患膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)[12-13]；維生素E可增加患前列腺癌和出血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)[14-15]；多烯磷脂酰膽堿使用過(guò)程中常出現(xiàn)嘔吐、皮疹、腹瀉等不良反應(yīng)，嚴(yán)重限制了上述藥物在臨床中的推廣[16]。因此，尋找更加安全有效的治療NAFLD藥物勢(shì)在必行。化滯柔肝顆粒具有清熱利濕、化濁解毒、祛瘀柔肝之功，臨床用于治療非酒精性單純性脂肪肝濕熱中阻證[17]。然而，有關(guān)化滯柔肝顆粒治療NAFLD的作用機(jī)制研究較薄弱，目前多停留在臨床觀察中。近年來(lái)，腸-肝軸的研究模式已在NAFLD的研究中逐步獲得國(guó)內(nèi)外學(xué)者的認(rèn)可，腸道菌群亦成為探討NAFLD的研究熱點(diǎn)。而代謝組學(xué)利用現(xiàn)代分析技術(shù)定量測(cè)定生物體液內(nèi)源性代謝產(chǎn)物變化，結(jié)合生物信息學(xué)闡明內(nèi)源性小分子代謝物變化規(guī)律，為揭示中藥發(fā)揮藥效的可能作用機(jī)制提供了可能[18]。因此，本研究聯(lián)合腸道菌群和代謝組學(xué)探討化滯柔肝顆粒治療NAFLD的作用機(jī)制，為化滯柔肝顆粒向臨床推廣提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

化滯柔肝顆粒（批號(hào)0051904010）購(gòu)自山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司；多烯磷脂酰膽堿膠囊（批號(hào)TC10004）購(gòu)自賽諾菲（北京）制藥有限公司；高脂飼料（批號(hào)D12451，配方為78.8%普通飼料、1%膽固醇、0.2%牛膽鹽、10%蛋黃粉、10%豬油）購(gòu)自協(xié)同生物科技有限公司。

三酰甘油（triacylglycerol，TG）試劑盒（批號(hào)A110-1-1）、總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒（批號(hào)F002-1-1）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒（批號(hào)A112-1-1）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒（批號(hào)A113-1-1）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。乙腈（批號(hào)1499230-935）購(gòu)自Merck公司，乙酸銨（批號(hào)70221）購(gòu)自Sigma公司，均為高效液相色譜純。

1.2 主要儀器

SAF-680T半自動(dòng)生化分析儀（上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司）；石蠟組織切片機(jī)（美國(guó)AO公司）；Nikon Eclipse E100型正置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）；AB Triple TOF 6600質(zhì)譜儀（AB SCIEX公司）；Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀（Agilent公司）；5430R低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；恒溫水浴鍋（北京醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.3 動(dòng)物

36只雄性清潔級(jí)SD大鼠，5周齡，體質(zhì)量（180±10）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2014-0001。本實(shí)驗(yàn)獲得鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生命科學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)K2020-0004。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥

SD大鼠飼養(yǎng)于溫度（26±2）℃、相對(duì)濕度（50±5）%的環(huán)境中。適應(yīng)環(huán)境3 d后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，分別為正常組、模型組、多烯磷脂酰膽堿膠囊陽(yáng)性藥組（PPC）、化滯柔肝顆粒高劑量組（HZRG-H）、化滯柔肝顆粒中劑量組（HZRG-M）、化滯柔肝顆粒低劑量組（HZRG-L），每組6只。正常組給予普通飼料，其余各組均給予高脂飼料8周復(fù)制大鼠NAFLD模型。各組均自由飲食、飲水，飼料和水每天更換1次。于實(shí)驗(yàn)第9周開(kāi)始，PPC組大鼠ig多烯磷脂酰膽堿膠囊0.144 g/kg，HZRG-H、HZRG-M、HZRG-L組大鼠分別ig化滯柔肝顆粒5.000、2.500、1.250 g/kg，正常組和模型組大鼠ig同體積生理鹽水，連續(xù)給藥4周。

2.2 樣本收集

末次給藥后，各組大鼠ip水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈采血，部分全血置于涂有肝素鈉的EP管中，其余全血放于普通試管中，離心（轉(zhuǎn)速3000×，10 min），分離上清液，其中血清用于測(cè)定TG、TC、HDL-C、LDL-C水平，血漿用于代謝組學(xué)研究；取部分肝臟組織，置于4%多聚甲醛固定用于病理學(xué)觀察；收集各組大鼠足量的盲腸內(nèi)容物于1.5 mL無(wú)菌EP管中，液氮速凍后置于超低溫冰箱?80 ℃保存，進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。

2.3 體質(zhì)量和血脂相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

于實(shí)驗(yàn)第8周和12周測(cè)量大鼠體質(zhì)量。使用檢測(cè)試劑盒檢測(cè)給藥4周后各組大鼠血清中的TG、TC、HDL-C、LDL-C水平。

2.4 油紅O染色觀察肝臟組織病理變化

取部分新鮮肝臟置于冰凍切片機(jī)上切取冰凍組織，甲醛-鈣固定10 min，蒸餾水洗滌，60%異丙醇浸洗30 s，油紅O染液染色15 min，60%異丙醇洗去多余染液，蘇木素復(fù)染5 min，蒸餾水洗滌3次，甘油明膠封片，光鏡下觀察病理改變。

2.5 16S rDNA測(cè)序

采用試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)各組大鼠樣本的盲腸內(nèi)容物DNA進(jìn)行提取，根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用NEB Next?Ultra?DNA Library Prep Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)通過(guò)Agilent Bioanalyzer 2100和Qubit進(jìn)行質(zhì)檢，采用Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)V3～V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，并利用線性判別分析效應(yīng)大小（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）和R軟件進(jìn)行表達(dá)和分析。

2.6 代謝組學(xué)分析

2.6.1 血漿樣本處理 將各組血漿緩慢解凍，取200 μL樣本加入預(yù)冷甲醇-乙腈-水溶液（2∶2∶1）600 μL，渦旋混合，低溫超聲30 min，?20 ℃靜置10 min，14 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清真空干燥；質(zhì)譜分析時(shí)加入100 μL乙腈水溶液（乙腈-水1∶1）復(fù)溶，渦旋，14 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液進(jìn)樣分析。

2.6.2 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為水-25 mmol/L乙酸銨-25mmol/L氨水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～0.5 min，95% B；0.5～7 min，95%～65% B；7～8 min，65%～40% B；8～9 min，40% B；9～9.1 min，40%～95% B；9.1～12 min，95% B；柱溫25 ℃；體積流量0.5 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。

2.6.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源溫度600 ℃，質(zhì)譜電壓5500 V（正離子模式），?5500 V（負(fù)離子模式），離子源氣體I 4.1×105Pa，氣體II 4.1×105Pa，氣簾（curtain gas）2.0×105Pa，碰撞能量（35±15）eV。

2.6.4 數(shù)據(jù)分析 將質(zhì)譜采集的數(shù)據(jù)信息導(dǎo)入R軟件，進(jìn)行多元數(shù)據(jù)處理，包括主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。多元OPLS-DA模型的變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）初步篩選出各組代謝物，選取VIP＞1.0且＜0.05的變量進(jìn)行進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析，最后將篩選出的差異代謝物導(dǎo)入京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）進(jìn)行代謝途徑的富集分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠體質(zhì)量變化

飼養(yǎng)8周后，與正常組相比，所有喂食高脂飼料大鼠體質(zhì)量均顯著升高（＜0.01），但各組之間無(wú)顯著差異（＞0.05），見(jiàn)圖1。給藥4周后，各組大鼠體質(zhì)量均有增長(zhǎng)，與模型組相比，PPC、HZRG-M、HZRG-H組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)顯著降低（＜0.05、0.01），說(shuō)明化滯柔肝顆粒具有減緩NAFLD大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)作用。

3.2 各組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C的變化

給藥4周后，與正常組相比，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C顯著升高（＜0.01），HDL-C顯著降低（＜0.05）；與模型組相比，各給藥組大鼠血清TC、TG均顯著降低（＜0.01），PPC組、HZRG-H組大鼠血清LDL-C顯著降低（＜0.05），PPC、HZRG-M、HZRG-H組大鼠血清HDL-C顯著升高（＜0.05、0.01），其余各組無(wú)顯著差異，見(jiàn)表1。

與正常組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.3 各組大鼠肝臟組織病理變化

油紅O染色顯示，正常組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，胞質(zhì)內(nèi)幾乎無(wú)紅色脂滴；模型組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)散在大小不等的脂滴空泡；PPC、HZRG-L、HZRG-M、HZRG-H組大鼠肝細(xì)胞間界限較模型組清晰，胞質(zhì)內(nèi)的脂滴均呈現(xiàn)不同程度的減輕，其中化滯柔肝顆粒3個(gè)劑量組脂滴數(shù)量與給藥劑量成反比（圖2）。

表1 各組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平()

與正常組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01

#< 0.05##< 0.01normal group;*< 0.05**< 0.01model group

圖2 各組大鼠肝臟組織病理變化(×200)

3.4 各組大鼠腸道菌群變化

鑒于HZRG-H組具有較好的藥效和改善NAFLD大鼠病理形態(tài)的作用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇HZRG-H組大鼠開(kāi)展腸道菌群和代謝組學(xué)研究。

3.4.1 多樣性分析

（1）α多樣性指數(shù)分析：采用α多樣性對(duì)各組大鼠腸道物種多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)，包括Shannon、Simpson、Ace、Chao指數(shù)，結(jié)果顯示3組之間雖無(wú)顯著性差異，但值得注意的是，與正常組相比，模型組Ace、Chao指數(shù)降低，與模型組相比，HZRG-H組可升高Ace、Chao指數(shù)，說(shuō)明高劑量的化滯柔肝顆粒可改善高脂飲食引起的NAFLD大鼠腸道菌群物種多樣性，結(jié)果見(jiàn)表2。

（2）β多樣性分析：采用Weighted Unifrac距離的β多樣性比較不同樣本間的腸道菌群組成差異，結(jié)果顯示HZRG-H組大鼠腸道菌群物種組成與模型相比差異明顯，與正常組大鼠腸道菌群物種β多樣性較接近，說(shuō)明高劑量化滯柔肝顆粒能夠糾偏高脂飼料引起的NAFLD大鼠腸道菌群群落組成差異，結(jié)果見(jiàn)圖3。

表2 各組大鼠腸道菌群α多樣性分析()

圖3 基于Weighted Unifrac距離的各組大鼠腸道菌群β多樣性分析

3.4.2 群落結(jié)構(gòu)分析 在門(mén)水平上，厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)是3組大鼠腸道菌群主要的門(mén)，但在各組中組成不同。與模型組相比，HZRG-H組大鼠腸道菌群厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)比值降低。在屬水平上，與正常組相比，模型組大鼠腸道菌群中屬相對(duì)豐度顯著升高（＜0.05）；與模型組相比，HZRG-H組大鼠腸道菌群中屬相對(duì)豐度顯著降低（＜0.05），結(jié)果見(jiàn)圖4-A～C。

3.5 各組大鼠腸道菌群LEfSe分析

LEfSe多級(jí)物種層級(jí)樹(shù)圖顯示了從門(mén)到屬水平各組腸道菌群變化，如圖5所示，HZRG-H組從綱水平調(diào)控放線菌綱、螺旋體綱、柔膜菌綱等優(yōu)勢(shì)菌，從屬水平調(diào)控杜氏乳桿菌屬、脫硫弧菌屬、Ruminococcaceae-UCG-010等優(yōu)勢(shì)菌。

3.6 各組大鼠代謝組學(xué)分析

3.6.1 代謝輪廓分析 PCA是一種可快速表征樣本差異信息的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法。因此，采用PCA對(duì)正、負(fù)離子模式下各組樣本間差異進(jìn)行分析，結(jié)果表明正常組與模型組明顯區(qū)分，HZRG-H組在正離子模式下部分樣本有向正常組轉(zhuǎn)化趨勢(shì)，見(jiàn)圖6。

3.6.2 差異代謝物篩選 基于OPLS-DA對(duì)正、負(fù)離子模式下檢測(cè)到的所有代謝物進(jìn)行差異分析，繪制正、負(fù)離子模式下代謝物火山圖（圖7），觀察差異代謝的分布。以同時(shí)滿足VIP＞1、＜0.05作為條件篩選差異代謝物，并結(jié)合HMDB、KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)，最終共篩選18個(gè)差異代謝物，其中負(fù)離子模式下12個(gè)，正離子模式下6個(gè)，見(jiàn)表3。

3.6.3 差異代謝物的相關(guān)通路分析 基于Metabo Analyst 5.0 KEGG進(jìn)行生物途徑分析，篩選潛在的關(guān)鍵代謝通路，結(jié)果顯示化滯柔肝顆粒主要通過(guò)調(diào)節(jié)氨酰-tRNA生物合成、膽汁分泌、膽固醇代謝等通路來(lái)發(fā)揮清熱利濕、化濁解毒、祛瘀柔肝的功效，見(jiàn)圖8。

3.7 腸道菌群與代謝組學(xué)關(guān)聯(lián)分析

為進(jìn)一步探討腸道菌群與代謝組學(xué)是否有相關(guān)關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合Spearman數(shù)據(jù)分析方法對(duì)模型組和HZRG-H組腸道菌群與代謝組學(xué)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果見(jiàn)圖9，HZRG-H組調(diào)控腸道菌群的關(guān)鍵菌屬為、-6、杜氏乳桿菌屬、脫硫弧菌屬、，其中、-6屬與-哌啶酸、-組氨酸代謝物呈負(fù)相關(guān)，與牛磺膽酸、神經(jīng)酸、2()-二十碳烯酸代謝物呈正相關(guān)，而杜氏乳桿菌屬、脫硫弧菌屬、與之相反。

mod-模型組 con-正常組 HZRG-化滯柔肝顆粒高劑量組（圖6同） A-門(mén)水平上各組物種豐度聚類(lèi)熱圖 B-屬水平上正常組與模型組樣本菌群差異 C-屬水平上模型組與HZRG-H組樣本菌群差異

圖5 各組大鼠腸道菌群LEfSe進(jìn)化分支圖

圖6 不同離子模式下各組大鼠血漿代謝物的PCA分析

圖7 不同離子模式下模型組和HZRG-H組代謝物火山圖

表3 正、負(fù)離子模式顯著性差異代謝物

圖8 KEGG富集通路圖

圖9 模型組和HZRG-H組腸道菌群與差異代謝物的相關(guān)性熱圖

4 討論

中醫(yī)古書(shū)籍中并無(wú)NAFLD病名記載，近代醫(yī)家根據(jù)其臨床癥狀將其歸屬于“肝癖”“肝積”“協(xié)痛”“積聚”等范疇[19]。如《圣濟(jì)總錄·癖氣》[20]記載：“癖氣者、聚于兩脅間。有時(shí)而痛是也。以其僻在肋下，故名癖氣”；《靈樞·百病始生篇》[21]記載：“留而不去，持舍于腸胃之外，募原之間，留著于脈，稽留而不去，息而成積”；《丹溪心法·脅痛》[22]記載：“脅痛，肝火盛，木氣實(shí)，有死血，有痰流注”。現(xiàn)代醫(yī)家結(jié)合古書(shū)籍記載及自身的臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為NAFLD主要病因與個(gè)體體質(zhì)、飲食不節(jié)、勞逸失度、情志失調(diào)等有關(guān)，且普遍認(rèn)為NAFLD早期多以肝郁脾虛為主，后期可演變?yōu)樘禎駜?nèi)阻、濕熱蘊(yùn)結(jié)，進(jìn)而發(fā)展為痰濕阻滯氣血循行，最終導(dǎo)致氣滯血瘀[23-24]。可見(jiàn)，NAFLD臨床多以本虛標(biāo)實(shí)為主要表現(xiàn)，本虛以肝、脾虛為主，標(biāo)實(shí)可見(jiàn)痰濕、氣滯、瘀血等因素，最終痰濕瘀互結(jié)，瘀阻肝絡(luò)。

化滯柔肝顆粒由決明子、茵陳、大黃、澤瀉、豬苓、山楂、炒蒼術(shù)、白術(shù)、陳皮、瓜蔞、女貞子、墨旱蓮、枸杞子、小薊、柴胡、甘草組成，2017年NAFLD中醫(yī)診療專(zhuān)家共識(shí)意見(jiàn)推薦化滯柔肝顆粒用于NAFLD的治療[25]。研究發(fā)現(xiàn)，決明子可通過(guò)調(diào)控屬、雙歧桿菌屬、黏液真桿菌屬相對(duì)豐度，改善腸屏障損傷，減少脂質(zhì)在肝臟的積累及NAFLD引起的肝損傷[26]；由大黃、澤瀉、白術(shù)組成的大黃澤瀉湯可提高NAFLD大鼠擬桿菌屬、顫螺旋菌屬和屬的相對(duì)豐度，抑制腸道Toll樣受體4信號(hào)通路，增加腸道緊密連接蛋白表達(dá)發(fā)揮治療NAFLD藥效[27]；枸杞中的枸杞多糖能增加脫鐵桿菌門(mén)，降低疣微菌門(mén)的相對(duì)豐度，上調(diào)短鏈脂肪酸水平，從而修復(fù)腸道屏障，發(fā)揮治療NAFLD作用[28]；茵陳可通過(guò)激活p38絲裂原活化蛋白激酶通路，促進(jìn)自噬進(jìn)而減少NAFLD小鼠肝臟TG沉積，保護(hù)肝細(xì)胞，延緩NAFLD的發(fā)展[29]；山楂中的山楂酸可通過(guò)抗炎及抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，有效改善高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠肝臟病變程度[30]；女貞子中有效成分女貞子總苷可通過(guò)抑制固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c、肝臟X受體-α和白細(xì)胞介素-6蛋白表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)血脂改善NAFLD[31]。可見(jiàn)，化滯柔肝顆粒可能是通過(guò)多組分、多通路發(fā)揮治療NAFLD的藥效。值得注意的是，目前化滯柔肝顆粒治療NAFLD的基礎(chǔ)研究較少，有學(xué)者[32]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)發(fā)現(xiàn)化滯柔肝顆粒通過(guò)活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素和漢黃芩素激活核心靶點(diǎn)白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子、表皮生長(zhǎng)因子等蛋白，進(jìn)而調(diào)控糖基化終產(chǎn)物/糖基化終末產(chǎn)物受體信號(hào)通路、人巨細(xì)胞病毒感染等信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗NAFLD藥效，但未得到進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，本研究聯(lián)合腸道菌群和代謝組學(xué)，明晰化滯柔肝顆粒治療NAFLD的作用機(jī)制。

首先，考察了化滯柔肝顆粒治療NAFLD的藥效。結(jié)果顯示，給藥4周后，與模型組相比，HZRG-H、HZRG-M組可顯著降低NAFLD大鼠體質(zhì)量（＜0.05、0.01）。HZRG-H、HZRG-M、HZRG-L組可顯著降低NAFLD大鼠TC、TG水平（＜0.01），HZRG-H、HZRG-M組可升高HDL-C水平（＜0.05、0.01），HZRG-H組還可顯著降低LDL-C水平（＜0.05），表明化滯柔肝顆粒具有較好的抗NAFLD藥效，且呈一定的量效關(guān)系。宋立艷等[33]選取88例濕熱蘊(yùn)結(jié)型NAFLD患者，分為2組，對(duì)照組口服硫普羅寧腸溶片，觀察組在此基礎(chǔ)上加服化滯柔肝顆粒，給藥2月后，發(fā)現(xiàn)觀察組有效率達(dá)93.18%，且TG、TC、HDL-C、LDL-C水平較治療前及對(duì)照組改善更明顯，該發(fā)現(xiàn)與本研究結(jié)果一致。此外，油紅O染色顯示不同劑量化滯柔肝可有效改善NAFLD大鼠肝臟病理狀態(tài)，提示化滯柔肝顆粒可有效減少脂滴在大鼠肝臟內(nèi)聚集。

其次，為了探討化滯柔肝顆粒治療NAFLD的作用機(jī)制，本研究采用16S rDNA觀察化滯柔肝顆粒對(duì)NAFLD大鼠腸道菌群的影響。結(jié)果顯示，與模型組相比，高劑量化滯柔肝顆粒可降低腸道菌群厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)比值，厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)比值是反映腸道菌群紊亂的重要指標(biāo)[34-35]，提示化滯柔肝顆粒可緩解NAFLD引起的腸道菌群紊亂。Liu等[36]發(fā)現(xiàn)化滯柔肝顆粒可改變高脂飲食小鼠腸道菌群的組成，降低厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)的比例，這與本研究結(jié)果一致。此外，與模型組相比，高劑量化滯柔肝顆粒可顯著降低屬相對(duì)豐度，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)豐度與肝纖維化指標(biāo)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β呈正相關(guān)[37]，表明化滯柔肝顆粒可能通過(guò)降低的豐度來(lái)減少NAFLD相關(guān)致病因子水平。值得注意的是，LEfSe分析顯示高劑量化滯柔肝顆粒可顯著提高大鼠腸道瘤胃球菌屬-UCG-010相對(duì)豐度。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)瘤胃球菌屬與NAFLD相關(guān)指標(biāo)如肝臟質(zhì)量、血清轉(zhuǎn)氨酶水平、肝臟脂肪變性和炎癥程度呈負(fù)相關(guān)[38]，上述研究結(jié)果提示化滯柔肝顆粒可能通過(guò)改善部分菌群豐度來(lái)發(fā)揮治療NAFLD的作用。

再者，本研究結(jié)合代謝組學(xué)進(jìn)一步觀察化滯柔肝顆粒對(duì)NAFLD大鼠體內(nèi)代謝物的影響。代謝組學(xué)結(jié)果顯示，高劑量化滯柔肝顆粒可上調(diào)鵝去氧膽酸鹽、牛磺膽酸、神經(jīng)酸含量，下調(diào)-哌啶酸等差異代謝物含量。有研究發(fā)現(xiàn)鵝去氧膽酸鹽是形成羥甲基戊二酰輔酶A、抑制膽固醇合成的關(guān)鍵物質(zhì)[39]。牛黃膽酸可緩解高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂肪變性、炎癥反應(yīng)、肥胖和胰島素抵抗[40]。NAFLD的形成與神經(jīng)酸濃度呈負(fù)相關(guān)[41]。腸道菌群對(duì)膳食-賴氨酸的分解代謝會(huì)引起血漿中-哌啶酸水平的升高，進(jìn)而加重慢性肝病的進(jìn)展[42]。以上報(bào)道結(jié)合本研究篩選的差異代謝產(chǎn)物結(jié)果，提示化滯柔肝顆粒發(fā)揮抗NAFLD藥效可能是通過(guò)調(diào)控多個(gè)代謝物共同發(fā)揮作用。同時(shí)，對(duì)上述差異代謝物進(jìn)行KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)化滯柔肝顆粒通過(guò)調(diào)控膽汁分泌、膽固醇代謝等途徑發(fā)揮抗NAFLD藥效，這為后期深入開(kāi)展化滯柔肝顆粒治療NAFLD作用機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。

最后，為了探討腸道菌群與代謝產(chǎn)物是否有依存關(guān)系，本研究對(duì)腸道菌群與代謝組學(xué)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，給予化滯柔肝顆粒后差異菌杜氏乳桿菌屬、脫硫弧菌屬與血漿中的代謝物-組氨酸、甘露醇呈顯著正相關(guān)，與甲基丙二酸呈顯著負(fù)相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)杜氏乳桿菌屬的豐度提高可減輕NAFLD大鼠肝臟和脂肪代謝紊亂、減少肝損傷和抑制肝臟炎癥細(xì)胞因子的釋放[43]。脫硫弧菌屬可提高硫化氫水平進(jìn)而觸發(fā)蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路改善NAFLD[44]。與此同時(shí)，關(guān)聯(lián)分析還顯示a屬與牛磺膽酸呈顯著正相關(guān)，而屬被認(rèn)為與腸道免疫穩(wěn)態(tài)有關(guān)，且屬下的與脂肪代謝直接相關(guān)[45]。

綜上，本研究通過(guò)腸道菌群及代謝組學(xué)聯(lián)合分析證實(shí)，化滯柔肝顆粒可通過(guò)調(diào)控NAFLD大鼠腸道菌群脫硫弧菌屬、杜氏乳桿菌屬、等菌屬豐度，進(jìn)而調(diào)控膽固醇代謝、膽汁酸等代謝相關(guān)通路來(lái)調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)堆積，發(fā)揮改善NAFLD作用。總之，本研究不僅為深入研究化滯柔肝顆粒干預(yù)NAFLD的作用機(jī)制提供依據(jù)，同時(shí)也為化滯柔肝顆粒的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Huazhi Rougan Granule in treatment of non-alcoholic fatty liver disease based on intestinal flora and metabolomics

ZHU Chun-sheng, SHI Ya-min, FU Zhi-hui, YU Dong-sheng, BIAN Meng, NIE An-zheng, LI Xiao-ping

The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China

To investigate the mechanism of Huazhi Rougan Granule (化滯柔肝顆粒) in treatment of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).Rats were fed a high-fat diet for eight weeks to establish a NAFLD model, and Huazhi Rougan Granules were administered intragastrically for four weeks. The semi-automatic biochemical analyzer was used to determine the blood lipid-related indicators in rats; Oil red O was used to observe the pathological changes of liver tissue; The Illumina Miseq sequencing platform was used to amplify and sequence the V3—V4 variable region, and UPLC-MS/MS was used to research plasma metabolomics. The correlation between intestinal flora and metabolomics was analyzed by Spearman.Compared with model group, the body weight (< 0.05, 0.01) and serum level of total cholesterol (TC) and triacylglycerol (TG) (< 0.01) of rats were significantly decreased and high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) of rats was significantly increased (< 0.05, 0.01) in Huazhi Rougan Granule medium and high dose groups. In addition, low density lipoprotein cholesterol (LDL-C) of rats was also significantly decreased in Huazhi Rougan Granule high dose group (< 0.05). Oil red O staining showed that the fat distribution in each administration group was lower than that of the model group. 16S rDNA sequencing showed that Huazhi Rougan Granule could increase the relative abundance of,, Ruminococcaceae-UCG-010 bacteria in NAFLD model rats. A total of 18 differential metabolites were identified by metabolomics, pathway analysis showed that the anti-NAFLD effects of Huazhi Rougan Granules was mainly through the regulation of aminoacyl-tRNA biosynthesis, bile secretion, cholesterol metabolism and other pathways.The mechanism of Huazhi Rougan Granules improving NAFLD may be related to the regulation of intestinal flora composition, cholesterol metabolism and other related metabolic pathways.

Huazhi Rougan Granule; non-alcoholic fatty liver disease; intestinal flora; metabolomics; cholesterol metabolism

R285

A

0253 - 2670(2023)04 - 1190 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.04.019

2022-11-12

河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃聯(lián)合共建項(xiàng)目（LHGJ20190273）；鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院橫向課題（K2020-0004）

朱春勝，男，碩士，主管藥師，研究方向?yàn)橹兴幏乐未x性疾病。E-mail: zhuchunsheng6@163.com

李曉萍，女，主任藥師，從事醫(yī)院藥學(xué)管理和中藥臨床藥學(xué)研究。Tel: (0371)66278520 E-mail: lixiaoping630209@163.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]