2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類對照提取物在白及質量控制中的應用研究

劉 剛，劉金梅，穆開朗，劉育辰，孫慶文，張永萍

2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類對照提取物在白及質量控制中的應用研究

劉 剛，劉金梅#，穆開朗，劉育辰*，孫慶文，張永萍

貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025

建立以2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類對照提取物為對照的白及質量控制方法。采用ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱，流動相為0.05%磷酸水溶液（A）- 乙腈（B），梯度洗脫，柱溫35 ℃，體積流量0.15 mL/min，進樣體積為2 μL，檢測波長為220 nm。分別采用對照品法和對照提取物法測定17批白及飲片中1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯-2-葡萄糖苷（2--葡萄糖基白及苷）、1-[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯（手參苷Ⅰ）、1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸-2-(6--乙酰基) 葡萄糖苷（手參苷Ⅲ）、1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯（白及苷）4個成分的含量，并進行比較。2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類對照提取物中2--葡萄糖基白及苷、手參苷Ⅰ、手參苷Ⅲ、白及苷線性關系良好（≥0.999 9），進樣精密度RSD值在0.001%～0.58%，重復性RSD值在0.27%～0.53%，4種成分的加樣回收率在98.42%～101.53%，樣品溶液在24 h內各成分穩定性良好。兩種方法測定結果進行檢驗，＞0.05，說明兩種方法無顯著差異，兩種檢測方法結果具備一致性。驗證了2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類對照提取物可代替單體對照品的可行性，可應用于白及及其制劑的質量控制研究。

白及；2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類；對照提取物；質量控制；2--葡萄糖基白及苷；手參苷Ⅰ；手參苷Ⅲ；白及苷

白及為蘭科植物白及(Thunb.) Reiehb. f.的干燥塊莖，具有收斂止血、消腫生肌的功效[1]。白及中主要含有白及多糖、2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類、聯芐類、菲類、黃酮類、苯丙素類、甾體、三萜等成分[2-6]。近年來許多學者對白及質量控制技術方法進行了研究和探索，從單一指標成分定量測定到多指標成分定量測定結合指紋圖譜等[7-9]這些研究成果無疑對白及質量評價和控制水平的提高起到了極大的促進作用，但是仍存在的對照品價格貴、不易得、檢測成本高，質控指標與藥效關聯性不強等問題。

《中國藥典》2020年版首次以1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯（白及苷）作為單一指標成分進行定量測定，白及苷為2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類化合物，除白及多糖成分外，此類化合物是白及中主要成分[10-12]，除了白及苷，此類成分中其他幾個化合物均難以獲得。由于中藥成分的多樣性，僅以單一成分作為檢測指標的檢測方法，其專屬性遠低于多指標檢測方法，且也無法體現中藥整體性概念。而使用對照提取物作為標準物質，相對于難獲得、高成本的單體對照品而言，其制備工藝更簡便易行。同時，使用對照提取物代替單一對照品可以實現同時測定多個成分的含量，更能反映中藥的整體質量[13-15]。

對照提取物系指經特定提取工藝制備的含有多種主要有效成分或指標性成分，用于中藥材（飲片）、提取物、中成藥等鑒別或含量測定用的國家藥品標準物質[16]。同時，規定對照提取物選取應從基原明確的中藥材（飲片）或其他動植物中提取獲得[17]。對照提取物相比單一對照品制備方法更簡單、檢測成本更低、適用性更好[18]。

在前期的研究中，本課題組優選了2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類白及對照提取物的制備工藝，對照提取物中1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯-2-葡萄糖苷（2--葡萄糖基白及苷）、1-[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯（手參苷Ⅰ）、1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸-2-(6--乙酰基) 葡萄糖苷（手參苷Ⅲ）、1,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯（白及苷）4個成分總含量超過70%，符合對照提取物的要求[19]，本研究以2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類對照提取物為對照，應用于白及藥材的質量控制，試圖構建高效、易行、科學的白及質量評價新模式。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超高效液相色譜儀（Agilent 1290 infinity II，美國Agilent公司）；FA2204B型電子天平（上海天美天平儀器有限公司）；AG135型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 試藥

乙腈為色譜純（美國TEDIA公司）；其他試劑均為分析純；純凈水（貴陽娃哈哈食品有限公司）；硅膠GF254薄層板（青島譜科分離材料有限公司，批號20210717）；PRP-512B型反相樹脂（北京聚福樹脂廠）。白及苷（批號CHB180528）購于成都克洛瑪生物科技有限公司；手參苷Ⅲ（批號PRF10102503）購于成都普瑞法科技開發有限公司，質量分數均大于98%；手參苷Ⅰ和2--葡萄糖基白及苷由本實驗室從白及中分離得到，質量分數均大于98%。17批不同來源的白及飲片經貴州中醫藥大學孫慶文教授鑒定為蘭科植物白及(Thunb.) Reichb. f.，詳細信息見表1。

2 方法與結果

2.1 2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類對照提取物的制備

精密稱取白及粉末（過三號篩），按1∶40料液比加入55%乙醇，超聲（功率344 W、頻率40 kHz）提取56 min，濾過，取上清液減壓濃縮，得藥材浸膏；按浸膏與PRP-512B型反相樹脂1∶150比例稱取PRP-512B型反相樹脂做好預處理（用95%的乙醇浸泡24 h后裝柱，使填料占總柱長約1/2，用95%乙醇沖洗至流分與水1∶5混合不渾濁，再用水洗至流分不含醇，即可），干法上樣，以水（3個柱體積）、20%乙醇（2個柱體積）、40%乙醇（3個柱體積）進行梯度洗脫，收集40%乙醇段的流分，減壓濃縮，真空干燥得對照提取物。

表1 17批白及飲片來源信息

2.2 2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類對照提取物的標定

以2--葡萄糖基白及苷、手參苷Ⅰ、手參苷Ⅲ、白及苷對照品為對照，測定白及對照提取物中4個2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類化合物的含量。

2.2.1 色譜條件 ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm×2.1mm，1.8 μm）色譜柱；流動相為0.05%磷酸水溶液（A）- 乙腈（B）；梯度洗脫，洗脫程序：0～2 min，18%～20% B；2～3 min，20%～20% B；3～6 min，20%～22% B；6～7 min，22%～23% B；7～9 min，23%～24% B；9～12 min，24%～26% B；12～16 min，26%～28% B；16～20 min，28%～100% B；20～24 min，100% B；進樣量2 μL；體積流量0.15 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長220 nm。混合對照品、飲片和白及對照提取物色譜圖見圖1。

2.2.2 混合對照品溶液的配制 分別精密稱取2--葡萄糖基白及苷、手參苷Ⅰ、手參苷Ⅲ、白及苷對照品適量，加50%乙醇溶解，配制成質量濃度分別為0.200 4、0.400 0、0.105 0、1.210 0 mg/mL的混合對照品溶液A。

1-2-O-葡萄糖基白及苷 2-手參苷Ⅰ 3-手參苷Ⅲ 4-白及苷

2.2.3 對照提取物供試品溶液配制 精密稱取白及對照提取物5.12 mg，置10 mL量瓶中，加50%乙醇溶解并定容至刻度、搖勻，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.2.4 線性關系考察 將上述混合照品溶液A分別稀釋10倍、50倍得到混合對照品溶液B、C；按“2.2.1”項下色譜條件，混合對照品溶液A分別進樣1、2、3、4、5 μL，混合對照品溶液B分別進樣1、3、5 μL，混合對照品溶液C分別進樣1、2、3 μL，測定各成分的峰面積，以各成分的進樣量為橫坐標（），峰面積為縱坐標（），繪制標準曲線，得回歸方程：相關系數（）均大于0.999 9，線性關系良好，結果見表2。

表2 4個指標成分的回歸方程及線性范圍

2.2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下的混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣6次，測定2--葡萄糖基白及苷、手參苷Ⅰ、手參苷Ⅲ、白及苷的峰面積，計算峰面積的RSD值，結果分別為0.13%、0.20%、0.38%、0.11%，表明儀器精密度良好。

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2.2.6 重復性試驗 取白及對照提取物按“2.2.3”項下方法平行制備6份白及對照提取物供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積。計算供試品溶液中2--葡萄糖基白及苷、手參苷Ⅰ、手參苷Ⅲ、白及苷的質量分數，其平均值分別為15.21%、4.47%、9.50%、58.22%，RSD值分別為1.08%、1.26%、1.08%、0.91%。

2.2.7 穩定性試驗 按“2.2.3”項下方法制備白及對照提取物供試品溶液1份，按照“2.2.1”項下色譜條件，分別于0、2、6、8、10、24 h進樣測定，記錄峰面積。計算供試品溶液中2--葡萄糖基白及苷、手參苷Ⅰ、手參苷Ⅲ、白及苷的峰面積的RSD值，分別為0.35%、0.14%、0.39%、0.28%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取同一批已知含量的白及對照提取物5.25 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，平行6份，分別精密加入不同濃度的2--葡萄糖基白及苷（0.767 00 mg/mL）、手參苷Ⅰ（0.220 0 mg/mL）、手參苷Ⅲ（0.484 80 mg/mL）、白及苷（2.984 00 mg/mL）對照品溶液各1 mL，再加入50%乙醇定容至刻度，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜濾過。按“2.2.1”項下的色譜條件進樣，記錄各成分峰面積，計算2--葡萄糖基白及苷、手參苷Ⅰ、手參苷Ⅲ、白及苷的加樣回收率分別為97.16%、97.78%、104.10%、96.10%，RSD分別為2.23%、2.99%、2.02%、1.17%，表明該方法準確度良好。

2.2.9 2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類對照提取物標定結果 取9批白及對照提取物，按“2.2.3”項下制備供試品，取適宜供試品按“2.2.1”項下色譜條件進樣檢測，測定9批白及對照提取物中2--葡萄糖基白及苷、手參苷Ⅰ、手參苷Ⅲ、白及苷，含量結果見表3，4個指標成分的含量之和均大于70%，9批對照提取物的平均值為81.95%，說明該制備方法具備良好的穩定性和可重復性。

表3 9批對照提取物含量標定

2.3 對照提取物在白及飲片質量控制中的應用

以2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類對照提取物為對照，測定白及飲片中2--葡萄糖基白及苷、手參苷Ⅰ、手參苷Ⅲ、白及苷共4個成分的含量，并與單體對照品測得的結果進行比較，考察對照提取物用于飲片質量控制的科學性和可行性。

2.3.1 薄層鑒別 取白及飲片粉末（過三號篩）0.20 g，加入50%乙醇10 mL，超聲處理（功率400 W、頻率40 kHz）30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加入1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。取白及2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類對照提取物配制成33 mg/mL的溶液。對照薄層色譜法（通則0502）試驗。吸取供試品溶液、對照提取物溶液各5 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸-水（6.5∶3.5∶0.1∶1）下層為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照提取物色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

1-對照提取物（A-手參苷Ⅰ B-白及苷 C-手參苷Ⅲ D-2-O-葡萄糖基白及苷） 2～18-不同批次白及飲片

2.3.2 含量測定

（1）對照提取物溶液制備：精密稱取白及對照提取物5.12 mg，置10 mL量瓶中，加50%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成2--葡萄糖基白及苷、手參苷Ⅰ、手參苷Ⅲ、白及苷質量濃度分別為0.079 9、0.023 1、0.049 5、0.302 0 mg/mL的對照提取物溶液A；將上述對照提取物溶液A分別稀釋10、50倍，作為白及對照提取物溶液B、C。

（2）白及飲片供試品溶液制備：取白及飲片粉末約0.20 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇溶液10 mL，稱定質量，超聲（400 W、40 kHz）處理30 min，放冷。再稱定質量，用50%乙醇補足減失的質量，搖勻，將提取液經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

（3）色譜條件：同“2.2.1”項下的色譜條件。

（4）線性關系考察：將“（1）”項下的對照提取物溶液A分別進樣1、2、3、4、5 μL；對照提取物溶液B分別進樣1、2 μL；對照提取物溶液C進2 μL；以進樣量為橫坐標（），峰面積為縱坐標（），繪制標準曲線，得回歸方程：相關系數（）均大于0.999 9，線性關系良好，結果見表4。

表4 4個指標成分的回歸方程及線性范圍

（5）精密度試驗：精密吸取“（1）”項下的對照提取物溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣6次，測定2--葡萄糖基白及苷、手參苷Ⅰ、手參苷Ⅲ、白及苷的峰面積，計算峰面積的RSD，結果分別為0.28%、0.32%、0.58%、0.001%，表明儀器精密度良好。

（6）穩定性試驗：取白及飲片粉末，按“（2）”項下的方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，分別于0、2、6、8、24、48 h進樣測定，記錄峰面積。計算供試品溶液中2--葡萄糖基白及苷、手參苷Ⅰ、手參苷Ⅲ、白及苷的峰面積RSD，分別為0.66%、0.66%、0.67%、0.35%，表明供試品溶液在48 h內穩定。

（7）重復性試驗：取同一批白及飲片粉末，按“（2）”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積。計算供試品溶液中2--葡萄糖基白及苷、手參苷Ⅰ、手參苷Ⅲ、白及苷的質量分數，其平均值分別為5.03、1.39、3.55、19.95 mg/g，RSD分別為0.48%、0.27%、0.53%、0.30%，表明該方法重復性良好。

（8）加樣回收率試驗：取已知含量的同一批白及飲片粉末約0.10 g，精密稱定，置于10 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇溶液9 mL，稱定質量，超聲（400 W，40 kHz）處理30 min，放冷。再稱定質量，用50%乙醇補足減失的質量，再精密加入配制好的白及對照提取物溶液1 mL，搖勻，平行制備6份。按“2.2.1”項的色譜條件進樣，計算2--葡萄糖基白及苷、手參苷Ⅰ、手參苷Ⅲ、白及苷的加樣回收率分別為101.53%、98.42%、101.44%、99.59%；RSD分別為1.06%、1.25%、1.47%、0.75%。表明該方法準確度良好。

（9）白及飲片含量測定：取17批購買的白及飲片，精密稱定，按“（2）”項下方法制備白及供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件，進樣測定峰面積，分別采用白及對照提取物法和單體對照品法計算樣品中的（2--葡萄糖基白及苷、手參苷Ⅰ、手參苷Ⅲ、白及苷）4個成分的含量，結果見表5。

根據表5中的結果，取2種方法測定的不同來源飲片中4個成分含量及4個成分含量總和的平均值（對照提取物法：0.60%、0.21%、0.35%、3.10%、4.26%；單體對照品法：0.57%、0.20%、0.32%、2.94%、4.04%），用SPSS 25.0進行配對樣本檢驗，在配對樣本相關性結果中＜0.05，兩組數據有顯著的相關性，可進行配對檢驗。由配對樣本檢驗的結果知＝0.102，＞0.05，說明兩組數據無顯著差異，兩種檢測方法結果具備一致性，進一步驗證了白及對照提取物可替代單體對照品進行白及飲片含量測定的可行性。

表5 17批白及飲片含量測定

3 討論

本實驗考察供試品和對照品在相同條件下使用不同展開系統的分離情況。分別考察三氯甲烷-甲醇-甲酸（3∶1∶0.1）、二氯甲烷-甲醇-甲酸（2.5∶1∶0.5）、乙酸乙酯-甲醇-甲酸（4∶1∶0.1）、三氯甲烷-甲醇-水（6.5∶3.5∶1）下層、三氯甲烷-甲醇-甲酸-水（6.5∶3.5∶0.1∶1）下層等5個展開劑下分離的情況。結果顯示以三氯甲烷-甲醇-甲酸-水（6.5∶3.5∶0.1∶1）下層為展開劑的分離效果最好。此外，還考察不同硅膠薄層板對供試品和對照品分離效果的影響。取硅膠G薄層板、硅膠GF254薄層板、硅膠H薄層板、硅膠HF254薄層板在相同條件下對樣品進行展開，結果以硅膠GF254薄層板分離效果最好。

本實驗考察了乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水、乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.05%甲酸水、乙腈-0.05%醋酸水、乙腈-水、甲醇-0.05%磷酸等流動相系統，結果表明，乙腈-0.05%磷酸水溶液為流動相梯度洗脫時色譜峰峰形較好，分離較好。考察了UPLC色譜柱在25、30、35 ℃溫度下各成分的分離效果，結果顯示在35 ℃下各個色譜峰分離較好。考察了在0.3、0.2、0.12、0.15、0.1、0.08 mL/min下各成分間的分離效果，結果顯示在0.15 mL/min下各個色譜峰分離較好。

白及藥材經過超聲提取，經過一次柱色譜即可制備得到符合標準的以4個（2--葡萄糖基白及苷、手參苷Ⅰ、手參苷Ⅲ、白及苷）2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類成分作為總控成分的對照提取物。對照提取物制備簡單，相對于單體化合物的制備節約了成本和時間。在對照提取物與單體對照品就含量測定結果的驗證中，其兩者結果經統計分析發現具有高度一致性，說明將制備得到的對照提取物，作為白及藥材含量的測定指標具有可行性。在白及質量評價研究中，對照提取物法的操作步驟更為簡便，在一定程度上降低了操作誤差，其重復性及可靠性更高。

藥物或組分的有效性是臨床應用的基本要求，有研究報道2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類對照提取物中的白及苷還具有改善慢性腦缺血大鼠的認知功能障礙及減輕腦白質缺血性損傷[20]、體外抗炎活性[21]、對PM 2.5誘導的BV-2細胞損傷有保護作用[22]；2--葡萄糖基白及苷對HIV有潛在的抑制作用[23]；手參苷Ⅰ還可縮短肝素化小鼠的出血時間和凝血時間[24]。綜上，制備得到的2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類對照提取物可代替單體化合物作為對照品進行含量測定的基礎上，還可與安全性、有效性密切相關，可為后期開發應用及臨床應用奠定基礎。

基于2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類對照提取物建立的白及UPLC含量測定方法，可為白及質量控制評價方法進一步的完善提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on application of glucosyloxybenzyl 2-isobutylmalates reference extract in quality control of

LIU Gang,LIU Jin-mei, MU Kai-lang, LIU Yu-chen, SUN Qing-wen, ZHANG Yong-ping

Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China

To establish of a quality control method forwith glucosyloxybenzyl 2-isobutylmalates reference extract as a control.A ZORBAX Eclipse Plus C18(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm) column was used with the mobile phase of 0.05% phosphoric acid aqueous solution (A)-acetonitrile (B), gradient elution, column temperature of 35oC, flow rate of 0.15 mL/min, injection volume of 2 μL, detection wavelength of 220 nm. The contents of dactylorhin A, gymnoside I, gymnoside III and militarine in 17 batches oftablets were determined by the control method and the control extract method, respectively, and compared.The linearity of dactylorhin A, gymnoside I, gymnoside III and militarine in the reference extract of glucosyloxybenzyl 2-isobutylmalates was good (≥0.999 9), the precision of the injection RSD values were in the range of 0.001%—0.58%, the reproducibility RSD values were in the range of 0.27%—0.53%. The recoveries of the four components ranged from 98.42% to 101.53%, and the stability of the sample solutions was good within 24 h. The results of the two methods were determined by-test,＞0.05, indicating that there was no significant difference between the two methods and the results of the two assays were consistent.This study verified the feasibility of glucosyloxybenzyl 2-isobutylmalates reference extract as a substitute for the monomeric control, which can be applied to quality control studies ofand its preparations.

(Thunb.) Reiehb. f.; glucosyloxybenzyl 2-isobutylmalates; reference extract; quality control; militarine;gymnoside I; militarine; gymnoside III; dactylorhin A

R286.12

A

0253 - 2670(2023)04 - 1260 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.04.027

2022-08-09

國家自然科學基金項目（U1812403）；貴州省科技計劃項目（黔科合基礎[2019]1027號）；國家公益性行業科研專項經費項目（201507002）

劉 剛（1979—），男（漢族），吉林白城人，高級實驗師，碩士研究生導師，研究方向為中藥資源學和中藥鑒定學。E-mail: liugang888_2000@163.com

劉育辰（1982—），女（漢族），吉林長春人，教授，博士，碩士研究生導師，研究方向為中藥及民族藥資源分類鑒定與質量控制。E-mail: lyc8564732@163.com

#共同第一作者：劉金梅（1997—），女（苗族），貴州貞豐人，碩士研究生，研究方向為中藥及民族藥化學及中藥新藥的研究。E-mail: 1943456442@qq.com；

[責任編輯 時圣明]