重慶地區煙葉辣椒脈斑駁病毒的檢測與鑒定

田紹銳，溫玉霞，馬 婷，陳海濤，徐 宸，汪代斌，孫現超*

1. 西南大學植物保護學院，重慶市北碚區天生路2 號 400715

2. 重慶煙草科學研究所，重慶市北碚區天生路216 號 400715

煙草病毒病是煙草生產上的重要病害之一［1］，一旦發生流行會造成嚴重的經濟損失［2］。因此，對煙草病毒病的有效防治已成為煙草生產上急需解決的問題［3］。據報道，煙草上已分離到的病毒種類有47種，我國煙草上已鑒定出的病毒有17種［4-5］，重慶煙區煙草上已鑒定出的病毒有9 種，包括煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黃 瓜 花 葉 病 毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、馬鈴薯 Y 病毒（Potato virus Y，PVY）、番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）、煙草番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）和馬鈴薯 X 病毒（Potato virus X，PVX）等［6-9］。辣椒脈斑駁病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）為（+）ssRNA 病毒，屬于馬鈴薯Y 病毒科馬鈴薯Y 病毒屬（Potyvirus），主要為蚜蟲以非持久性方式進行自然傳播，傳播擴散速度快，該病毒在全球多個國家和地區廣泛發生，嚴重危害辣椒和煙草［10］。2000 年報道該病毒侵染煙草［11］，2015年首次報道在重慶辣椒上檢測出ChiVMV［12］。該病毒具有較強的致病性和破壞性，侵染煙草后會誘發系統性葉片枯斑，感病部位細胞壞死。隨著病毒的擴散癥狀越發嚴重，煙草葉片自下而上干枯脫落甚至整株死亡［13］。隨著交通和物流業的快速發展，病毒的遠距離傳播率增加。ChiVMV這個局部區域發生的病毒也開始在新的煙區出現。近兩年來，在重慶煙區發現了葉片出現黃化斑點、枯斑等癥狀的煙株，疑似報道的ChiVMV感染癥狀。為了明確發病植株中是否含有ChiVMV，以及是否為復合侵染，采用分子生物學檢測方法對重慶煙區出現疑似ChiVMV侵染癥狀的煙葉樣品進行病毒種類檢測鑒定，并確定當前煙草病毒的種類、發生及復合侵染情況，旨在有針對性地制定綜合防治措施，進而有效控制病毒病。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

于2019—2020 年在重慶涪陵（11 份）和巫溪（6份）兩個煙區采集發病煙草樣品17份，在重慶北碚區西南大學煙草試驗田采集發病煙草樣品1份，煙葉表現出不同程度的花葉、黃化、皺縮、枯斑等癥狀。病原鑒定在西南大學植物保護學院植物免疫與病害生態防控實驗室完成。

RNA 提取試劑 RNAiso Plus（Code No. 9109）、rTaqTMPolymerase［寶日醫生物技術（Takara）有限公司］；反轉錄試劑盒NovoScrip Plus All-in-onev1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（E047，蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司）；大腸桿菌Escherichia coli DH5α、T 載體（北京全式金生物技術有限公司）；DNA 回收試劑盒Universal DNA Purification Kit（北京擎科生物科技有限公司）；所用引物均由深圳華大基因股份有限公司合成；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇等均為分析純（重慶市鈦新化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反轉錄

采用RNAiso Plus 進行煙葉總RNA 提取，方法詳見 https：//www.takarabiomed.com.cn/DownLoad/91 08-9109.pdf。使用近岸蛋白NovoScrip Plus All-inonev1st Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒進行反轉錄，參考說明書（https：//www.novoprotein.com.cn/Public/Uploads/uploadfile/files/Molecule_DS/E047.pdf）進行操作。反轉錄體系：2×NovoScript Plus 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix 10 μL，RNA（100 ng）模板2 μL，gDNA Purge 1 μL，加入DEPC 處理水至20 μL。反轉錄程序：50 ℃反應20 min，75 ℃終止反應5 min，16 ℃保存5 min。

1.2.2 病毒外殼蛋白擴增、克隆及測序

根據NCBI 已報道上述病毒的外殼蛋白序列并參考本實驗室的前期研究［14］，使用下列引物進行試驗（表1）。PCR 擴增體系為：2×PCR Mix 10 μL，上下游引物（10 mmol/L）各1 μL，模板DNA（100 ng）1 μL，加ddH2O補足至20 μL。PCR擴增程序按照近岸蛋白2×Taq Master Mix（https：//www.novoprotein.com.cn/Public/Uploads/uploadfile/files/Molecule_DS/E005.pdf）說明書設置。

表1 RT-PCR擴增的特異性引物Tab.1 Specific primers used for RT-PCR

參考DNA回收試劑盒（北京擎科生物科技有限公司）操作說明（https：//tsingke-oss.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/prod/3d3703039c984637a97d8e033eb48 4c9.pdf）將目的條帶回收，并將回收的片段與pGEM-T Easy 載體連接后進行大腸桿菌轉化，于37 ℃條件下培養16 h 后挑選數個陽性克隆送至深圳華大基因股份有限公司進行測序。

1.2.3 進化關系分析

使用 BLAST（blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/）進行序列比對，選擇同源性較近或GenBank數據庫中已公布的病毒，用MEGA 7.0 軟件中的Clustal-W 程序進行比對分析，然后采用鄰近法（Neighbor-joining，NJ）構建進化樹，使用1 000 次自導復制驗證可信度［15-16］。使用DNAMAN軟件進行序列同源性比對分析［17］。

2 結果與分析

2.1 感病煙葉的癥狀分析

采集重慶涪陵（11 份）和巫溪（6 份）兩個煙區與北碚試驗田（1份）共18份發病煙葉樣品。樣品均表現出不同程度的花葉、黃化、皺縮和枯斑等癥狀。其中涪陵地區煙葉枯斑較多，巫溪地區發病煙葉有較多閃電斑點，北碚地區發病煙葉有較多黃色斑點狀病斑（圖1）。根據煙葉發病癥狀，推測巫溪地區煙葉樣品中可能含有PVY，且樣品中可能存在多種病毒復合侵染的情況。

圖1 病毒侵染煙葉樣品的癥狀表現Fig.1 Symptoms of tobacco samples infected by viruses

2.2 感病煙葉的RT-PCR分析

利用包括TMV CP、CMV CP、PVX CP、TSWV CP 和ChiVMV CP 在內的多個病毒特異性引物，對重慶涪陵、巫溪2個煙區及北碚煙草試驗田發病煙葉樣品的總RNA進行RT-PCR擴增，并檢測涪陵、巫溪2個煙區及北碚煙草試驗田發病煙葉的病毒種類，結果見表2。涪陵煙區煙葉擴增出TMV CP 和ChiVMV CP，沒有擴增出 CMV CP、PVY CP 和TSWV CP。巫溪煙區煙葉中擴增出TMV CP 和PVY CP，沒 有 擴 增 到 CMV CP、TSWV CP 和ChiVMV CP，見圖2。北碚煙草試驗田發病煙葉中擴增出ChiVMV CP，未檢出其他病毒。在18份樣品中，檢測到ChiVMV、TMV、PVY 3種病毒，總檢出率分別為66.67%、66.67%和22.22%。涪陵煙區煙葉樣品中檢測出ChiVMV和TMV，檢出率分別為100%和54.55%；巫溪煙區煙葉樣品中檢測出TMV 和PVY，檢出率分別為100%和66.67%；北碚煙草試驗田病葉樣品中檢測出ChiVMV，檢出率為100%。因此，重慶巫溪地區煙葉主要受TMV和PVY侵染，而涪陵地區煙葉主要受TMV和ChiVMV侵染。此次兩個煙區煙葉樣品中病毒檢測結果有所不同。涪陵煙區的11份煙葉樣品中均檢測出ChiVMV，其中有6份煙葉樣品中還檢測出TMV，形成“ChiVMV+ TMV”的復合侵染類型，復合侵染率為54.55%。ChiVMV的檢出率明顯高于TMV，可以推測在涪陵煙區ChiVMV 的侵染力強于TMV。巫溪煙區的6份煙葉樣品中均檢測出TMV，其中有4 份煙葉樣品中還檢測出PVY，形成“TMV+PVY”的復合侵染類型，復合侵染率為66.67%（表2）?？梢奣MV 的檢出率明顯高于PVY 的檢出率，推測在涪陵煙區TMV的侵染力強于PVY。

圖2 5種病毒CP RT-PCR擴增的電泳圖Fig.2 Electrophoretogram for detection of CP of 5 viruses amplified by RT-PCR

表2 煙草樣品的病毒侵染類型和檢出率Tab.2 Types and detection rates of viruses in tobacco samples

2.3 ChiVMV進化關系分析

將獲得的ChiVMV CP 分離物上傳至NCBI，利用Blast 對其CP 序列進行序列分析，將比對出的GenBank 中 12 個 ChiVMV CP 分離物構建系統進化樹。進化分析結果（圖3）顯示，ChiVMV CP 重慶煙草分離物與其中4分離物形成1個分支，其他8個分離物共同形成另1個分支。重慶涪陵煙草分離物與中國瀘州煙草（GenBank 登錄號MK405594）親緣關系最近，同源性為99.11%（表3）。將上述分離物進行序列比對分析，發現各CP分離物的N端變異程度較低，C端變異程度高于N端（圖4）。

圖4 ChiVMV CP分離物的基因序列比對Fig.4 Gene sequence alignment of ChiVMV CP isolates

表3 基于ChiVMVCP分離物的基因序列相似性比較Tab.3 Sequence similarity of CP gene based on ChiVMV isolates

圖3 基于ChiVMV CP分離物的基因序列進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on ChiVMV CP isolates

3 結論

①從重慶涪陵煙區煙葉樣品中檢測出ChiVMV和TMV，檢出率分別為100%和54.55%；重慶巫溪煙區煙葉樣品中檢測出TMV 和PVY，檢出率分別為100%和66.67%；重慶北碚煙草試驗田病葉樣品中檢測出ChiVMV，檢出率為100%。②在重慶涪陵、北碚地區煙葉樣品中首次檢測出ChiVMV。③重慶涪陵煙區煙葉樣品中檢測出的ChiVMV 的CP 序列與四川瀘州煙葉ChiVMV CP分離物親緣關系最近。