外源褪黑素對金線蘭有效成分含量及抗氧化酶活性的影響

何秀麗， 王人民

(浙江大學 農業與生物技術學院，種子科學與技術中心，浙江 杭州 310058)

金線蘭[Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl.]，俗稱金線蓮、鳥人參，是一種珍稀的蘭科開唇蘭屬多年生單子葉草本植物，生長環境多為低海拔常綠闊葉林下及峽谷陰涼濕潤處，全草可入藥[1]，民間常做藥膳[2]。金線蘭具有豐富的化學成分，如黃酮、生物堿、多糖[3]、氨基酸、礦物質[4]等，因這些物質具有抗氧化、降血壓、降血糖和提高免疫力等作用，金線蘭在臨床上具有重要應用價值[3]。由于金線蘭種子缺少胚乳，種胚敗育，極難萌發，目前金線蘭的生產主要為組織培養，具體為在培養基上生長4～5個月后，再轉移至基質中生長，之后便可采摘[5-6]。但因組培苗面臨生長空間有限、轉移過程中容易出現黃化枯萎等問題，且栽培管理技術尚不完善，使得金線蘭出現產量下降、有效成分含量低等問題。前人對金線蘭的研究多集中在化學成分和藥理作用方面[7-8]，而對組培苗轉移至移栽基質過程中的生長研究較少甚至沒有。

褪黑素(melatonin，MT)在1958年首次發現于牛的松果油體中，1995年首次在高等植物體內發現，隨后越來越多的研究表明MT在植物體內廣泛存在。褪黑素是一類胺類激素，具有調節機體晝夜規律和機體抗氧化等多種生理功能[9]。MT與生長素具有相同的合成前體，被認為是一種植物生長調節劑，參與植物的生長發育。科研工作者們對不同非生物脅迫下茄子、油菜、大豆等植物施加外源褪黑素進行了研究，結果表明，適量濃度的褪黑素可以增加植物的抗逆性[9]。褪黑素主要通過降低葉綠素降解、提高抗氧化酶活性、直接清除活性氧、和其他激素相互作用等途徑提高植物對逆境的抵抗能力[10]。作為胺類激素，褪黑素很容易被吸收，使用在植物上不會經過食物鏈富集而對人體產生不良影響，因此可以作為一種綠色的外源激素調節劑。關于褪黑素提高植物的抗逆性已在眾多文章中被證實，其中包括干旱[11-12]、高溫、強光[13-14]、鹽堿[15-18]、低溫[19]等逆境，但褪黑素是否可以改善金線蘭在組培轉移至基質過程中出現的黃化枯萎等問題未見有任何報道。所以，研究褪黑素對組培后轉移栽培的金線蘭有效成分和產量的影響具有重要的實踐意義。

本研究以福建紅霞為試驗材料，對從組培苗轉移至基質栽培的金線蘭幼苗進行3種濃度褪黑素根灌技術處理，通過測定植株形態、有效成分含量、葉綠素含量和抗氧化酶活性等指標，探明褪黑素在金線蘭組培苗轉移至基質栽培這一過程中所起的作用及其內在機制，旨在為利用褪黑素提高金線蘭組培苗移栽后的生長提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

福建紅霞(5月苗齡組培苗)，由杭州創美生物科技有限公司提供。MT購自上海阿拉丁醫藥有限公司。福建紅霞移栽前株高4.33 cm，莖粗 3.07 mm，葉長 3.13 cm，葉寬 2.46 cm，根長 2.40 cm，根粗1.20 mm，單株鮮重0.91 g，單株干重0.08 g，折干率8.73%。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

試驗開始前，挑選同一環境下組培長大的組培苗，清理根部組培基質，選取長勢一致的健壯無病害植株進行移栽。栽培基質為泥炭土∶樹麟∶細沙=2∶2∶1(體積比)，移栽前栽培基質用1 000倍多菌靈(1 g多菌靈可濕性粉劑溶于1 000 mL水)進行浸透，發酵2～3 d。幼苗移栽至50孔穴盤，于25 ℃恒溫培養室中生長，培養條件為14 h/10 h，光照強度為4 500 lx，相對濕度在75%～85%。

在預試驗的基礎上， MT共設置3個濃度：5 μmol·L-1(M1)，500 μmol·L-1(M2)，5 mmol·L-1(M3)，對照(CK)用蒸餾水代替。每個處理重復3次，每個重復50株苗。苗移栽后開始根灌不同濃度外源MT溶液，每個重復根灌2 000 mL，共根灌一次，生長30 d后取樣進行各項指標測定。

1.2.2 指標測定

生長指標：每個重復隨機選取10株幼苗進行株高、莖粗、葉寬、葉長、根長、根粗、鮮重的測量。幼苗于80 ℃烘箱中烘干至恒重，進行干重的測定。

葉片光合色素和根系活力：光合色素含量和根系活力測定參照王學奎等[20]。

有效成分含量：金線蘭幼苗鮮樣于60 ℃烘箱中烘干至恒重，磨粉過80目篩。總黃酮、總氨基酸和多糖含量測定參照施滿容等[21]，分別采用三氯化鋁顯色法、酸性茚三酮顯色法和苯酚濃硫酸法；總生物堿含量測定參照王菲等[22]，采用酸性染料比色法。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)、H2O2和抗氧化酶：PAL測定參照Zhang等[23]，H2O2測定參照Su等[24]，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性測定參照龔動庭[25]。

1.3 數據處理與分析

采用Excel 2019和SPSS22.0軟件進行數據分析，多重比較采用LSD法，顯著性水平α=0.05。

2 結果與分析

2.1 MT根灌處理對金線蘭幼苗生長的影響

用MT藥劑根灌處理金線蘭30 d后如圖1所示，對金線蘭植株各個指標進行測量發現，與對照相比，3種濃度MT處理的福建紅霞幼苗株高、莖粗和葉寬均無顯著差別(表1)。MT藥劑處理完植株后，除M3處理的金線蘭鮮重減少外，其余處理每株金線蘭的鮮重和干重也沒有顯著變化(表1)。但是經M3處理后的植株根長顯著低于對照組，根長降低20.88%；在M1和M2濃度下，金線蘭根粗顯著高于對照組，分別提高了16.10%和15.25%(表1)。MT藥劑處理后幼苗葉長、根長和根粗出現相同的趨勢，即隨著MT濃度的提高，該3項指標的值均逐漸降低(表1)。

表1 不同濃度MT處理對金線蘭幼苗生長和產量的影響

圖中標尺為1 cm。

對金線蘭植株進行移栽前(五月苗齡組培苗)和MT藥劑根灌處理30 d后的生長數據進行對比發現，與對照相比，3種濃度MT處理對株高、莖粗、葉寬、鮮重、干重和折干率增長量無顯著差別，但葉長、根長和根粗增長量隨著MT濃度的增加出現遞減趨勢(表2)。其中，對照組的莖粗和根粗出現負增長(表2)，表明移栽后的金線蘭在生長過程中可能出現了不適應。

表2 金線蘭生長30 d前后各生長指標增量

2.2 MT根灌處理對金線蘭代謝物含量的影響

MT根灌處理對金線蘭代謝物的含量影響如圖2所示。由圖2可知，M1和M3處理的金線蘭植物體內的總黃酮含量均顯著提高，增幅分別為27.27%和33.06%(圖2-A)，但金線蘭體內總生物堿的含量并沒有受到MT根灌處理的影響(圖2-B)。總氨基酸的含量在MT處理后，都有顯著的變化，M1處理下，金線蘭幼苗體內總氨基酸含量顯著增加，增幅為21.79%，然而，隨著MT濃度的提高，植株體內總氨基酸含量呈現下降趨勢，M3處理的金線蘭幼苗總氨基酸含量比對照組顯著降低了50%(圖2-C)。M2和M3處理下，金線蘭幼苗體內多糖含量顯著增加，增幅分別為20.79%和23.88%(圖2-D)。

柱狀圖上無相同小寫字母的表示各處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

對金線蘭植株移栽前和MT藥劑根灌處理30 d后的代謝物含量進行對比發現，與移栽前相比，生長30 d后對照組總黃酮含量、多糖含量和總生物堿含量減少，MT處理總黃酮、多糖含量增加，且M1和M3處理總黃酮增量顯著高于對照，M2和M3處理多糖增量顯著高于對照(表3)。對照組和MT處理組總生物堿含量與移栽前相比均降低，但MT延緩了總生物堿含量的減少(表3)。與移栽前相比，生長30 d后金線蘭植株體內氨基酸積累，M1處理總氨基酸增加量顯著高于對照45.39%(表3)。

表3 金線蘭生長30 d前后代謝物增量

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是連接初級代謝和次級代謝的關鍵酶，本文對金線蘭幼苗根系和葉片中PAL活性的測定結果表明，根系和葉片中PAL活性與黃酮含量變化趨勢一致，即在M1和M3處理下，植物葉片與根系中PAL活性均顯著提高，葉片中分別提高了18.24%和36.09%，根系中分別提高了71.43%和180.21%(圖3)。

圖3 不同濃度MT對金線蘭PAL活性的影響

2.3 MT根灌處理對金線蘭葉綠素的影響

金線蘭體內的葉綠素含量的多少直接與其生長狀態和代謝物含量的變化相關。MT處理對葉綠素總量、葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素的含量的影響如圖4所示。結果表明，金線蘭幼苗葉片中葉綠素總量、葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素的含量較對照處理均顯著提高，在3個不同濃度的MT處理下，葉綠素總量、葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量均有明顯增加，增幅分別達41.56%～55.84%、33.82%～45.59%、88.89%～133.33%和25.00%～30.71%(圖4)。

圖4 不同濃度MT對金線蘭光合色素含量的影響

對金線蘭植株移栽前和MT藥劑根灌處理30 d后的葉綠素含量進行對比發現，與移栽前相比，生長30 d后，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量和類胡蘿卜素的增加量均顯著高于對照(表4)。其中，M1處理葉綠素a、葉綠素總量和類胡蘿卜素的增量分別高出對照164.29%、533.33%和38.46%；M2處理葉綠素a、葉綠素總量和類胡蘿卜素的增量分別高出對照221.43%、716.67%和51.28%；M3處理葉綠素a、葉綠素總量和類胡蘿卜素的增量分別高出對照164.29%、533.33%和35.89%。

表4 金線蘭生長30 d前后光合色素增量

2.4 MT根灌處理對金線蘭H2O2含量和根系活力的影響

H2O2在植物根系的發育建成中起著重要的信號調節作用，MT處理對金線蘭根系中H2O2含量和根系活力的影響如圖5所示。由圖可知，MT顯著促進了根系中H2O2的積累，但對葉片中H2O2含量無顯著影響(圖5-A)。同時，結果也表明根系活力的變化趨勢同黃酮含量變化(圖2-A)和PAL活性變化(圖3)趨勢一致。與對照相比，M3處理金線蘭幼苗根系中H2O2和根系活力分別顯著提高216.51%和44.44%(圖5)。

圖5 不同濃度MT對金線蘭H2O2含量和根系活力的影響

2.5 MT根灌處理對金線蘭抗氧化酶活性的影響

MT處理對福建紅霞4種抗氧化酶活性的影響如圖6所示。結果表明，與對照相比，MT處理組幼苗葉片和根系中抗氧化酶活性均有不同程度的顯著提高。經MT處理后，金線蘭葉片中SOD、POD、CAT活性均顯著高于對照，其中M1處理金線蘭葉片SOD、POD和CAT活性分別比對照增加23.72%、180.00%和33.65%；M2處理金線蘭葉片SOD和POD活性分別比對照增加31.18%和115%；M3處理金線蘭葉片SOD、POD和CAT活性分別比對照增加30.69%、405.00%和25.00%。M3處理下金線蘭根系CAT和APX活性分別比對照增加126.31%和58.30%；M2處理下金線蘭根系SOD活性比對照增加40.83%；3種濃度MT處理金線蘭根系POD活性分別比對照增加68.17%、33.27%和100.18%。以上結果說明，MT處理提高了移栽金線蘭葉片和根系的抗氧化酶活性，從而增強了金線蘭幼苗移栽過程中的生長適應性。

圖6 不同濃度MT對金線蘭抗氧化酶活性的影響

3 討論與結論

MT作為植物的生長調節劑，增強植物的抗逆性，因此，在植物從培養基轉入基質恢復生長的過程中也發揮著作用。從結果上看，500 μmol·L-1(M2)和5 mmol·L-1(M3)MT抑制了轉入基質后金線蘭根部的伸長，但是促進了根部直徑的變大。Yang等[26]用100 μmol·L-1和1 000 μmol·L-1MT處理擬南芥幼苗后發現，兩種濃度MT處理均顯著抑制了擬南芥幼苗初生根的生長。在Chen等[27-28]的研究中發現，MT可激活其下游的活性氧信號，促進H2O2含量積累，H2O2調控植物根系形態建成，促進或抑制根系的生長。本試驗中，根灌MT后幼苗葉片中H2O2含量無顯著改變，但根系中H2O2含量出現了明顯的隨MT濃度增加而增加的趨勢，推斷MT可能影響金線蘭根系中H2O2含量進而影響金線蘭幼苗的根系變化。

雖然MT根灌處理30 d后，金線蘭的地上部分沒有顯著的變化，但是其體內的總黃酮含量、總氨基酸含量和多糖含量都發生顯著的增高。MT主要是在低濃度(5 μmol·L-1)下促進了總黃酮和總氨基酸含量，高帆等[29]的研究表明，MT預處理可顯著提高獼猴桃幼苗體內總黃酮含量，有效增強獼猴桃幼苗的生活力。MT調控植物類黃酮代謝，在植物次級代謝中起著關鍵作用[30]。在植物次級代謝中，PAL作為一種關鍵酶連接初級代謝與次級代謝，使植物代謝進入苯丙烷途徑，經MT處理的金線蘭幼苗PAL活性顯著提高，推測MT可能通過提高PAL活性增強金線蘭黃酮類物質代謝，促進黃酮積累。但是MT對多糖含量的影響主要在高濃度(5 mmol·L-1)時可以顯著增加金線蘭體內的多糖含量。

MT促進次生代謝物的積累可能和葉綠素含量有關。檢測葉綠素的含量后發現，MT在3個濃度下都顯著增加了總葉綠素、葉綠素a、b、類胡蘿卜素的含量。杜卓等[31]研究表明，干旱脅迫下，MT可顯著提高玉米幼苗葉綠素合成，提高玉米光合作用，從而提高玉米對干旱脅迫的耐受力。Tan等[32]對MT與葉綠素之間的關系進行了探究，發現MT可以降低葉綠素分解基因和葉片衰老基因的表達，減少了不利條件下葉綠素的損失。金線蘭幼苗葉片葉綠素含量提高可能與MT提高其抗逆性、延緩葉綠素降解有關。

MT作為一種自由基清除劑，能夠清除多余的自由基，提高植物抗氧化能力。MT影響根系活力、葉綠素含量和次級代謝物積累可能受抗逆能力的作用，因此試驗中測定了抗氧化酶(SOD、POD、CAT、APX)的活性，發現3種濃度的MT在一定程度上都顯著增加了金線蘭葉片和根系中抗氧化酶活性。

綜上而言，MT可通過增加葉綠素含量，促進次生代謝物積累，提高抗氧化酶活性，從而提升金線蘭幼苗的抗逆性，促進植株根系直徑增大，增強根系活力，有利于金線蘭從培養基轉移到基質后的適應性生長，且5 μmol·L-1為金線蘭幼苗最佳根灌濃度。該結果可能對金線蘭組培后進行轉移栽培提供理論指導。