無患子提取液抗氧化能力初步研究

馬康勇，王冰燕，蔡曉儀

(麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院，浙江 麗水 323000)

無患子(Sapindus mukorossi)，《本草綱目》稱之為木患子，別名還有肥皂樹，黃金樹，主要分布在長江流域及其以南區(qū)域，是南方常見的寺廟樹，庭園樹[1-2]。無患子微辛，味苦，性寒，毒性較小，在傳統(tǒng)應(yīng)用中，其根、莖、皮、葉、果實在傳統(tǒng)運用中皆可入藥，可用于癬疾、腫毒等外科疾病，也可以用于名族用藥，其具有提升皮膚彈性和增加皮膚光澤的功效，因此其被應(yīng)用在園林，工業(yè)，化妝品，植物文化等諸多領(lǐng)域，因其具有良好的起泡性和去污性，民間常將其果實代替肥皂使用[3-4]。

圖1 皂苷A和B化學(xué)結(jié)構(gòu)

根據(jù)現(xiàn)代研究表明，皂苷是無患子中重要活性成分，作為一種天然表面活性劑，具有良好的抗氧化性的同時還具有顯著抗菌作用，綠色安全且不產(chǎn)生抗藥性，其在醫(yī)用藥物、日用化學(xué)品以及環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用價值日益凸顯，具有廣闊的開發(fā)前景和極大的應(yīng)用價值[5]。

提取無患子中的“骨髓”皂苷類，目前常見的提取方法主要有大孔吸附樹脂法、超聲波協(xié)同提取法、水提法、醇提法、發(fā)酵法、復(fù)合酶法等[6-7]。其中，在工業(yè)生產(chǎn)中可操作性強，生產(chǎn)工藝較成熟的是水提法和醇提法，其具有操作簡便、原理易懂、質(zhì)量把控度高、制作成本小等諸多優(yōu)點；超聲波協(xié)同提取和微波法等其他方法由于操作難度大，所需成本高，在實際生產(chǎn)中有不可避免的局限性。

化學(xué)上自由基，亦稱“游離基”，是指化合物的共價鍵在光照，加熱，輻射等一定條件的影響下，吸收外界能量，發(fā)生斷裂，形成了帶有孤對電子的原子或者基團。它具有強氧化性和磁矩的特性，成為人體生命活動活性中間體[8]，與人體健康成為“命運共同體”。自由基利弊一體化，成為一把雙刃劍。人具有可以對自由基進行分解的酶，加強自身抗氧化性。然而，年齡增長的同時，體內(nèi)的酶活性亦開始逐步下降，最終那些日積月累的自由基無法再被體內(nèi)抗氧化能力削弱，驅(qū)除。自由基增多，膠原蛋白結(jié)構(gòu)被改變，功能被削弱，使皮膚營養(yǎng)補充不足，造成皮膚老化等弊端，甚至其腐蝕侵害體內(nèi)蛋白細胞的數(shù)量和脂肪細胞的程度與日俱增，過多的脂褐素，致使色斑顯現(xiàn)頗深。本實驗旨在研究無患子抗氧化活性與提取工藝條件之間的關(guān)系，以期為無患子的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

(1)儀器與設(shè)備

UV-1100紫外分光光度計，上海美普達儀器有限公司；800型離心沉淀器，上海手術(shù)器械廠；JY-501電子天平，上海浦春計量儀器有限公司；HH-11-2電熱恒溫水浴鍋，上海助藍儀器科技有限公司。

(2)試劑與材料

DPPH (1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)，C2H5OH(無水)，F(xiàn)eSO4，H2O2(8.8 mmol·L-1)，水楊酸，K3[Fe(CN)6]，TCL，F(xiàn)eCl3，Na2HPO4，NaH2PO4，KH2PO4，K2HPO4，HCl，Na2CO3等，以上試劑均為分析純試劑。無患子采自海寧山區(qū)為當(dāng)季采摘，參考文獻[9]將其制成粉末。

2 實驗步驟

(1)配置不同固液比：分別取90 ℃，50 mL、100 mL、150 mL、200 mL、250 mL、300 mL的蒸餾水于不同燒杯中，隨后分別向其加入1.0 g精確稱量的無患子粉末，置于90 ℃水浴鍋中保溫30 min，過濾，收集濾液，即為提取液。

(2)設(shè)置不同提取溫度：向6個燒杯中分別加入50、60、70、80、90、100 ℃的蒸餾水各200 mL隨后分別向其加入1.0 g精確稱量的無患子粉末，按加入的水溫各保溫30 min，過濾，收集濾液，即為提取液。

(3)設(shè)置不同提取時間：向6個燒杯中分別加入200 mL，90 ℃蒸餾水，隨后分別向其加入1.0 g精確稱量的無患子粉末，在90 ℃下分別保溫10、20、30、40、50、60 min，過濾，收集濾液，即為提取液。

圖2 提取工藝流程圖

3 無患子皂苷抗氧化活性測定方法

3.1 無患子提取液還原力測定

精確吸取1.0 mL不同提取液稀釋10倍于試管中作為待測液，向其加入待測液、PBS磷酸緩沖溶液(0.2 mol·L-1，pH=6.6)、1%K3[Fe(CN)6]溶液各2.50 mL，充分混勻，置于50 ℃水浴鍋中保溫20 min，隨后，冰水浴終止反應(yīng)，加10% TCL溶液2.50 mL，將待測液置于離心管中，于3 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液2.50 mL，加2 mL去離子水和0.1%三氯化鐵溶液0.50 mL，靜置10 min，作為實驗組在700 nm波長處測定吸光度(A)，無還原能力蒸餾水作為對照組[9]。

A總還原力=A樣品-A空白

3.2 清除DPPH·能力測定

精確吸取1.0 mL不同提取液稀釋10倍于試管中作為樣品液，精確稱取DPPH 9.9 mg，溶解于無水乙醇并定容至250 mL容量瓶，將2 mL C2H5OH和2 mL DPPH溶液加入試管中，充分混合。避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測定其吸光值(A0)。取2 mL樣品液與2 mL DPPH溶液混合后避光反應(yīng)30 min，在相同波長處測其吸光度(Ai)，另取2mL樣品液與2 mL無水乙醇溶液混合后避光反應(yīng)30 min在相同波長處測其吸光度(Aj)，每組試驗平行3次，實驗結(jié)果取平均值[9]。

3.3 清除·OH能力測定

精確吸取1.0 mL不同提取液稀釋10倍于試管中作為樣品液，精確吸取FeSO4(9 mmol·L-1)、水楊酸-乙醇(9 mmol·L-1)和樣品液各1.0 mL，隨后加入1 mL H2O2(8.8 mmol·L-1)，在37 ℃水浴鍋中中反應(yīng)0.5 h，在510 nm處測定吸光度(Ax)[9]。

式中：A0為無樣品時吸光度；Ax為加入樣品液體后吸光度；Ax0為不加顯色劑H2O2、加茶樣的吸光度。

3.4 無患子樣品液清除超氧陰離子測定

精確吸取1.0 mL不同提取液稀釋10倍于試管中作為樣品液，取2.50 mL、50 mmol·L-1的PBS磷酸鹽緩沖溶液(pH=8.34)于試管中，后加入2 mL樣品溶液，再加入0.25 mL的鄰苯三酚(10 mmol·L-1)，在25 ℃下保溫4 min，加入1滴10 mol·L-1HCl，終止反應(yīng)；將相同的樣品液作為參比，在325 nm處測定吸光度值(A1)。用蒸餾水代替樣品溶液，加入與測試樣品相同的其它試劑，以pH=8.34的PBS溶液做參比，在325 nm處測其吸光度值，得到空白吸光度值(A0)[9]。

4 結(jié)果與討論

4.1 各單因素與提取液總還原能力的關(guān)系

4.1.1 料液比與提取液總還原能力的關(guān)系

皂苷提取過程中料液比對皂苷的得率有著重要影響。固液比太小則導(dǎo)致溶劑與皂苷之間的交換不充分導(dǎo)致皂苷得率下降，從而影響所得提取液抗氧化活性；固液比過大會造成所得液中皂苷濃度過低要進行濃縮后處理，增加生產(chǎn)成本[10]，因此，工業(yè)生產(chǎn)中要尋找合適的固液比。圖3為不同固液比與無患子提取液總還原能力的關(guān)系圖。當(dāng)固液比處于(1∶50)～(1∶300)的范圍內(nèi)時，隨著固液比的不斷增大，溶劑體系內(nèi)皂苷濃度逐漸降低導(dǎo)致無患子皂苷的還原能力逐漸減弱。無患子皂苷的提取是依靠細胞內(nèi)外的濃度差作為推動力，在一定范圍內(nèi)隨提取溶劑占比的增加，隨著溶劑量的增大，細胞內(nèi)外濃度差也逐漸增大，反應(yīng)的推動力隨之增大，越有利于皂苷的傳質(zhì)速率提高[11]。然而，當(dāng)料液比繼續(xù)增大，體系內(nèi)溶劑過量，溶劑分子相互作用，不利于溶劑與皂苷間充分循環(huán)交換[10]。此外，還會有其它雜質(zhì)析出進入體系，使浸提液黏度增大，擴散速度變慢，導(dǎo)致皂苷類化合物難溶出，使得皂苷提取液中皂苷含量下降從而影響提取液還原能力。研究結(jié)果表明，在固液比為1∶50，即提取溶劑水的量為無患子粉末質(zhì)量50倍時，無患子提取液還原能力最強。

圖3 各單因素與提取液總還原能力關(guān)系

4.1.2 提取時間與提取液總還原能力的關(guān)系

皂苷與溶劑相互作用時間會影響無患子皂苷得率，從而影響提取液的抗氧化活性。將1.0 g無患子粉末與200 mL蒸餾水混合均勻共設(shè)置6組，在90 ℃條件下分別保存10、20、30、40、50、60 min，實驗結(jié)果見圖(3)可以看到在10～60 min范圍內(nèi)，隨提取時間的增長，無患子提取液還原能力逐漸增強。這是因為，隨著提取時間的增加，無患子粉末中的各物質(zhì)組分會逐漸擴散到溶劑中，在一定范圍內(nèi)隨時間的增加各物質(zhì)在溶劑中的濃度增大，因此無患子提取液的還原能力在一定范圍內(nèi)隨提取時間的變化逐漸增強[12]。

4.1.3 提取溫度與提取液總還原能力的關(guān)系

分子熱運動速率與溫度有密切聯(lián)系，因此，在不同提取溫度下溶劑分子、水分子和無患子粉末中各類物質(zhì)的熱運動速度和擴散速度都將發(fā)生改變，從而影響皂苷的得率，進而影響提取液的總還原能力，將1.0 g無患子粉末與200 mL蒸餾水混合均勻共設(shè)置六組，分別在50、60、70、80、90、100 ℃條件下提取30 min得到無患子提取液還原能力與提取溫度的關(guān)系如圖3所示。由圖3可以看到在60～80 ℃，無患子提取液抗氧化能力隨溫度的上升快速增強，隨著溫度升高，皂苷分子運動速率和擴散的速率顯著增加，有助于皂苷于溶劑分子接觸交換，皂苷溶解度增大。當(dāng)提取溫度超過80 ℃后，隨溫度上升，提取液還原能力逐漸下降，這可能是因為高溫破壞了無患子皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致皂苷活性成分失活，同時也會造成部分皂苷發(fā)生水解，生成副產(chǎn)物，使得皂苷有效活性成分急劇下降，進而影響提取液的還原能力[13]。

4.2 各單因素與提取液自由基清除率關(guān)系

4.2.1 料液比與提取液自由基清除率關(guān)系

圖4 各單因素與自由基清除率關(guān)系

4.2.2 提取時間與提取液自由基清除率關(guān)系

4.2.3 提取溫度與提取液自由基清除率關(guān)系

綜合上述研究結(jié)果，本實驗通過水提法提取無患子粉末中的皂苷，以提取液總還原能力和對自由基清除率為因變量以提取條件為自變量，得出較優(yōu)提取條件為：按固液比為1∶200 (g·mL-1)，在溫度為70 ℃，提取時間為45 min時，達到預(yù)期研究目標。

5 結(jié) 論

近年來，隨著人們對天然抗氧化活性成分研究的興起，使無患子中含有的天然抗氧化成分皂苷備受各界關(guān)注。研究無患子的抗氧化活性和對自由基的清除能力，有利于更加高效地利用無患子，并且為無患子產(chǎn)品研發(fā)利用提供理論依據(jù)，為“天然洗護珍果”無患子煥發(fā)新的活力奠定理論依據(jù)。隨著對無患子研究力度地不斷加大，對于無患子皂苷，應(yīng)多方位，多層次，多領(lǐng)域分析其結(jié)構(gòu)特點，對比和總結(jié)其不同結(jié)構(gòu)與功能之間的聯(lián)系，未來針對無患子的綜合開發(fā)利用事業(yè)將進一步深入發(fā)展。