基于HPLC方法測定預灌封注射器組合件中丙烯酸浸出量

周光耀，余黛媚，張 怡

(廣州伯朗氏檢測技術有限公司，廣東 廣州 510000)

近年來，預灌封注射器(PFS)是興起的實用、新型注射劑包裝容器。相比傳統的注射劑瓶橡膠塞的包裝系統，PFS具有方便可靠、標識清晰、用藥劑量更準確等優點，可減少潛在的醫療事故發生，也可最大限度地減少與藥品溢出相關的藥物浪費，逐漸成為疫苗、治療型蛋白類藥物的首選容器[1-2]。使用PFS作為藥品包裝容器時，必須關注其與所含藥物產品和相關形式的相容性[3]，以確保患者安全和藥物質量，因此了解PFS可提取物和可浸出物(E&L)對于評估毒理學和藥物質量風險至關重要。由于蛋白質具有廣泛的表面積和更多的潛在相互作用位點，結構復雜，活性與構象變化密切相關，蛋白類生物制品可能更容易受到包裝系統中化學浸出物的影響[4]。

PES主要由玻璃針筒、橡膠活塞、注射針、護帽和推桿五部分組成。在PFS加工過程中將針頭固定到玻璃筒上需要的粘合劑作用。紫外光UV固化膠是常用的PES粘合劑，而丙烯酸酯類膠粘劑作為常見的UV膠[5]，是以丙烯酸及其酯類為主要原料，與其他物質共聚而制得。根據文獻報道，丙烯酸作為丙烯酸粘合劑的化學組分之一，可能浸出至各種配方的蛋白質產品中，通過邁克爾反應，丙烯酸可以在賴氨酸、N-末端和組氨酸三個不同的位置發生相互作用[6]。被從粘合劑浸出的丙烯酸改性后，治療性蛋白質可能會發生電荷和疏水性的變化，從而導致蛋白質結構和功能的改變[7]，有研究報道了特定蛋白IgG2和浸出的丙烯酸之間的相互作用[8]。可浸出物與蛋白質產品之間的相互作用會導致產品質量變化，盡管這樣的變化不會引起即刻的毒理學問題，但是從長期來看，仍然會對患者的安全性產生不利影響，因此，對于特別容易受到化學浸出物影響的治療性生物蛋白產品，需要使用科學合理的方法對可能影響藥品穩定性的浸出物進行評估[9]。預灌封注射器屬于高風險輸液產品，UV膠長時間接觸到藥液，所浸出的丙烯酸含量可能會影響針劑藥品的質量安全。

因此，本文開發了高效液相色譜法(HPLC)，以水為介質，檢測預灌封注射器中丙烯酸的浸出量，該方法具有操作簡單、重復性好、靈敏度高的特點。對不同來源的PFS進行提取研究和浸出研究，有效加強高風險產品質量控制，為企業對藥包材的選擇和適用性評估方面提供參考依據。

1 儀器、試劑與材料

高效液相色譜儀帶紫外檢測器，日本島津公司(Agilent 1220型)；電子天平(精度為0.01 mg)，德國sartorius公司(BT25S)。

丙烯酸(純度99.8%)購自德國CNW Technologies GmbH；甲醇購自默克化工技術有限公司(MERCK)；磷酸購自邁瑞達(MREDA)。

預灌封注射器組合件(帶注射針)來自A、B廠家。

2 試驗方法與結果

2.1 溶液配制

2.1.1 供試液的制備

取超純水1 mL分別灌裝至預灌封注射器中，用橡膠活塞密閉后倒置使針頭部位向下，置高壓蒸汽滅菌鍋中，121 ℃下分別保持0.5 h、1 h、2 h、3 h和4 h。相同的條件下制備不接觸預灌封注射器的水提取空白樣品。量取經過提取的樣品溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，用水稀釋定容，即得供試液。

2.1.2 對照品溶液配制

精密稱取丙烯酸對照品約20.00 mg，使用超純水溶解得0.2 mg/mL丙烯酸對照品貯備液。逐步稀釋得4.00 μg/mL的對照品溶液。

2.2 HPLC分析方法

色譜柱：SHIMADZU C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相0.1%磷酸：甲醇(體積比為80∶20)；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長220 nm；進樣量5 μL。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性試驗

取空白提取液、對照品溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結果見圖1～圖2。結果顯示丙烯酸的保留時間為3.54 min。空白液圖譜中在丙烯酸位置處無明顯吸收峰，不干擾測定。加標提取液中基質物質不干擾測定。結果表明該方法專屬性好。

圖1 對照品溶液色譜圖

圖2 空白溶液色譜圖

2.3.2 線性關系考察

取對照品貯備液，用水稀釋至濃度為0.43、2.15、4.30、8.59和17.20 μg/mL的系列濃度溶液，分別進樣測定，記錄峰面積。以峰面積A為縱坐標，濃度C為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y=13 228.296 07x-125.297 57，r=0.999 8。結果表明，丙烯酸在0.43～17.20 μg/mL濃度范圍內線性關系良好。

2.3.3 定量限和檢測限考察

取對照品溶液，用甲醇逐級稀釋至濃度為0.017 μg/mL，信噪比為5.1，即儀器檢測限為0.017 μg/mL。取對照品溶液，用甲醇逐級稀釋至濃度為0.043 μg/mL，信噪比為13.4，即儀器定量限為0.043 μg/mL。

2.3.4 精密度和穩定性試驗

精密吸取對照貯備液1 μL置于50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，制得加標溶液。取適量的對照溶液連續進樣6次，記錄峰面積。結果顯示RSD為0.7%，加標樣品的變異系數均小于5%，表明精密度良好。

取加標溶液，分別室溫放置0 h、24 h、48 h、72 h進樣測試，記錄峰面積。結果顯示RSD為2.6%，表明丙烯酸在提取基質中72 h內穩定性良好。

2.3.5 回收率試驗

精密吸取對照貯備液1 μL、10 μL和20 μL置于50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，制得水的加標溶液。對照貯備液稀釋加標濃度分別為2.15 μg/mL、4.30 μg/mL和8.59 μg/mL，每個濃度平行制備3份，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定結果見表1。結果顯示低、中、高濃度相應的回收率分別為100.1%、99.8%、100.1%，平均回收率為100.0%，回收率的RSD為0.78%。結果表明本方法回收率良好。

表1 加樣回收試驗結果

2.4 PES中丙烯酸提取量的測定

按“2.1.1”和“2.1.2”項下方法分別制備供試品及對照溶液，按“2.2.1”項下色譜方法進樣測試，以外標曲線法計算供試品溶液中丙烯酸含量，結果見圖3。結果顯示隨著提取時間的延長，丙烯酸的提取量增加，提取時間為0.5～2 h內提取量明顯增加，2 h以后提取量增長速度放緩，趨于穩定。

圖3 不同提取時間PFS中丙烯酸的提取量

2.5 加速條件下丙烯酸的浸出量

采用水作為水基性藥品的模擬液，相對于室溫存儲，在提高接觸溫度的條件下測試預灌封注射器中丙烯酸的浸出量。測試對象為不同廠家(A、B廠家)來源的預灌封注射器，各取三批次預灌封注射器，灌裝純化水1 mL，用橡膠活塞密閉后倒置使針頭部位向下，置于鼓風干燥箱中，溫度分別設置為40 ℃和60 ℃，于10天和30天取樣。同法放置不接觸預灌封注射器的水作為空白樣品。

按“2.1.1”和“2.2.2”項下方法分別制備對照品及供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜方法進樣測試，以外標曲線法計算供試品溶液中丙烯酸浸出量，結果見表2。結果表明，不同廠家來源的預灌封注射器中丙烯酸浸出量有明顯差異。

表2 加速條件下丙烯酸的浸出量

3 討 論

在本研究建立了一種高效液相色譜法，用于檢測來源于預灌封注射器針頭粘合劑中浸出的丙烯酸。該方法準確性高，線性關系良好。通過測定不同時間點的丙烯酸可提取量，綜合考慮提取效率和時間成本，121 ℃下高壓蒸汽滅菌2 h為初步篩選預灌封注射器的適宜提取條件。在對不同廠家的預灌封注射器在加速條件下進行考察后，試驗結果表明不同來源的注射器中丙烯酸浸出量存在明顯差異。

丙烯酸對皮膚、眼睛和粘膜具有強烈的刺激性，但目前尚無關于丙烯酸對人類生殖、發育或致癌作用的確切信息[10-11]。動物癌癥研究報告了陽性和陰性結果，美國環境保護署(EPA)未將丙烯酸歸類為致癌物質，屬于國際癌癥研究機構第IARC 3類物質。推薦的丙烯酸口服參考劑量(RfD)為0.5 mg/kg/天[12](來源于美國環保署(EPA)的綜合風險信息系統)。從口服途徑推導至腸胃外給藥途徑乘以10%[13]，體重以50 kg計，丙烯酸腸胃外給藥途徑的每日暴露量為2.5 mg/day。本研究檢測的丙烯酸浸出量遠低于該每日暴露量，安全性風險較低。但可浸出的丙烯酸可引起蛋白質改性。據報道[14]，當可浸出丙烯酸濃度約為5 μg/mL時，約0.02%～0.3%的蛋白質會被丙烯酸改性，這會對蛋白質濃度較低的治療性生物制劑產生不可忽視的影響。而且需要注意，隨時間推移，浸出的丙烯酸量會不斷累積，導致在長期儲存中存在更多的蛋白質被修飾而失效的風險。

鑒于生物制藥的特殊性，選擇藥品包裝材料時應特別注意避免其浸出物與蛋白質藥品之間的相互作用，確保產品質量。預灌封注射器中可提取物和浸出物的相關指導原則對PFS系統相容性研究具有一定的借鑒作用，在國內外缺乏丙烯酸的相容性研究標準的情況下，全面地探究影響丙烯酸提取的關鍵因素對后續研究有一定的指導作用。

4 結 論

本研究建立的HPLC方法簡便，準確，可靠，可適用于檢測預灌封注射器組合件浸出物中丙烯酸的含量。