基于LC-MS法對不同提取條件下生物反應袋中bDtBPP含量分析

余黛媚，張 怡，周光耀，李月菊

(廣州伯朗氏檢測技術有限公司，廣東 廣州 510000)

近年來，一次性使用系統(Single-Used System，SUS)在生物制藥領中得到廣泛應用。該系統專為單次使用或單一產品生產而設計的生物加工設備，特別適用于涉及動物細胞培養的工藝，如治療性抗體、激素、重組蛋白、酶和疫苗的生產。一次性系統具有建設周期短、組裝靈活、成本低廉、生產效率高和可避免交叉污染等優點，是生物醫藥生產的重要創新。一次性生物反應袋(Single-Used Bags，SUBs)代表了生物制藥生產中的一個重要改進，在新工藝開發和中試規模生產中有廣泛的應用。

為保證其性能與穩定性，用于生產反應袋的高分子聚合物需添加抗氧化劑、潤滑劑、增塑劑、澄清劑和穩定劑等添加劑。根據USP PF <665>[1]，這些添加劑或其相關化合物、降解產物將在與液體接觸時從系統中溶出，作為與工藝設備相關的浸出物(PERL)進入工藝流體中，可能會以浸出物形式存在于最終藥品中。因此，在使用一次性系統的同時也面臨新的挑戰，例如潛在的有毒或抑制性浸出物從系統中釋放，進入工藝流體(如含細胞的培養基)而導致細胞生長抑制、昂貴細胞株丟失和產量下降等問題。浸出物帶來的風險是生物醫藥企業面臨的重要課題，各國監管部門出臺方案、法規和指南[2-3]，提出了對可提取物和浸出物(E&L)的風險評估思路和研究策略。生產企業和申請人作為主要責任方，須確保所采用一次性系統符合預期用途。

一次性生物反應袋(SUBs)在某些處理條件或在最差條件下，接觸層材料中溶出的化合物可能導致藥品的有效性下降，是一次性系統的主要缺點之一。塑料添加劑抗氧劑168的降解產物雙(2，4-雙叔丁基苯基)磷酸酯(bDtBPP，CAS 69284-93-1)被認為是一種溶出物[4]，對中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株系具有細胞毒性[5-6]，目前尚無標準化的操作規程對bDtBPP的溶出行為進行測試。

本文采用高效液相色譜-質譜聯用技術測定提取液中bDtBPP的含量，該方法具有高靈敏度和高選擇性的特點，降低了假陽性檢測結果的出現概率。通過考察不同的前處理方式和提取條件對bDtBPP可提取量的影響，探討影響bDtBPP釋放行為的因素，為生物制藥過程中如何科學選擇SUBs提供了參考。

1 儀器、試劑與材料

儀器：AB SCIEX 4000高效液相-三重四級桿串聯質譜聯用儀，美國AB SCIEX公司；電子天平，德國sartorius公司(精度為0.01 mg)。

試劑：雙(2，4- 雙叔丁基苯基)磷酸酯(69284-93-1，純度98.0%)，上海昶衍化工科技有限公司；氨水、甲醇(均為質譜純)，阿拉丁；無水乙醇(色譜純)，邁瑞達(MREDA)。

一次性生物反應袋(國外A廠家提供)，為多層高分子生物膜，膜材內表面液體接觸層材質為低密度聚乙烯(LDPE)。

2 方法與結果

2.1 溶液配制

2.1.1 供試液制備

50%乙醇作為提取溶劑，使得袋子內表面積與提取溶劑體積的比例約為6 cm2/mL，稱重。將灌裝提取溶劑的袋子置于水浴震蕩器中后設置水浴溫度，震蕩頻率60 rpm。提取結束后拭干袋子表面后稱重，提取前后的重量損失不得超過20%。

取50%乙醇灌裝至玻璃試劑瓶中密閉，采用相同的提取條件，制備不接觸袋子的空白提取液。

樣品溶液經0.2 mm濾膜過濾后即為供試液。

2.1.2 對照品溶液配制

精密稱取bDtBPP對照品20.38 mg，用甲醇溶解得濃度為0.2 mg/mL bDtBPP對照品貯備液。使用甲醇逐級稀釋后得0.50 μg/mL的對照品溶液。

2.2 LC-MS分析方法

2.2.1 色譜條件

ACE Excel 3 C18-AR色譜柱(4.6 mm×150 mm，3 μm)；流動相：A為0.05%積比)氨水溶液，B為0.05%(體積比)氨水甲醇。梯度洗脫程序：0～4.0 min，B由90%升至100%；4.0～6.0 min，B為100%；6.0～6.1 min，B由100%降至90%；6.1～13.00 min，B為90%；流速0.5 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。

2.2.2 質譜條件

點噴霧離子源(ESI)，負離子模式，多反應檢測(MRM)模式；霧化氣為空氣，氣體壓力為55 psi；干燥氣溫度為300 ℃；霧化氣壓力50 psi；噴霧針電壓 -4 500 V；母離子 473.2 Da，子離子205.2 Da；解簇電壓(DP)-130 V；碰撞能量(CE)-60 V。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性試驗

取提取空白、對照品溶液注入高效液相-三重四級桿串聯質譜聯用儀。待測物bDtBPP的保留時間為2.14 min。提取空白液圖譜中在bDtBPP位置處無明顯吸收峰，不干擾測定，見圖1和圖2。

圖1 空白溶液的LC-MS圖譜

圖2 對照品溶液的LC-MS圖譜

2.3.2 系統適用性試驗

取2.1.2對照品溶液按“2.2”項下儀器條件進樣測定，連續進樣6次，記錄峰面積，計算得RSD為2.1%。

2.3.3 線性試驗

取對照品貯備液2，用甲醇稀釋至濃度為0.13、0.50、2.52、5.04、10.08和20.16 μg/mL 的系列濃度溶液，分別進樣測定，記錄峰面積。以峰面積A為縱坐標，濃度C為縱坐標，進行線性回歸，得回歸曲線為A=1 137.342 71x+ 406.641 46，r=0.999。結果表明，bDtBPP在0.13～20.16 μg/mL 濃度范圍內線性關系良好。

2.3.4 精密度和穩定性試驗

精密吸取對照貯備液制得加標溶液，平行制備6份，按照方法進行檢測，計算峰面積的RSD為1.4%，加標樣品的變異系數均小于5%，結果表明精密度良好。

取上述加標溶液，室溫放置，分別于0 h、24 h、48 h、72 h進樣測試，計算峰面積的RSD為4.2%，表明bDtBPP在提取基質中72 h內穩定性良好。

2.3.5 回收率試驗

精密吸取對照貯備液用50%乙醇稀釋成濃度分別為0.50 μg/mL、2.5 μg/mL和10.0 μg/mL的加標溶液，平行制備3份，進樣測定。結果顯示低、中、高濃度相應的回收率分別為102.0%、100.1%、98.9%，每個濃度點回收率的RSD為0.5%、1.0%、0.2%。結果表明本試驗方法的回收率良好。

2.3.6 檢測限與定量限

取對照品貯備液，用甲醇逐級稀釋至濃度為0.007 μg/mL，信噪比為6.6，即儀器檢測限為0.007 μg/mL。用甲醇逐級稀釋至濃度為0.02 μg/mL，信噪比為12.8，即儀器定量限為0.02 μg/mL。

2.4 樣品的檢測

2.4.1 不同滅菌方式對bDtBPP提取量的影響

在提取試驗前采用伽瑪射線輻照滅菌(輻照強度為25 kGy)、環氧乙烷滅菌和濕熱滅菌(121 ℃下處理30 min)的方式對袋子進行處理。取滅菌后袋子，設置提取溫度為40 ℃，提取時間為48 h，按“2.1.1”項下方法分別制備供試液進樣測試，進樣測試，記錄峰面積，以外標法計算提取液中bDtBPP含量(μg/mL)，結果見表1。結果顯示環氧乙烷滅菌和濕熱滅菌的滅菌方式下，未檢出bDtBPP含量，在瑪射線輻照的滅菌方式下bDtBPP含量為0.23 μg/mL。結果表明在伽瑪射線輻照下的滅菌方式可用于提取bDtBPP。

表1 不同滅菌方式對bDtBPP的提取量的影響

2.4.2 不同提取溫度對bDtBPP提取量的影響

在提取試驗前采用伽瑪射線輻照對袋子進行處理，輻照強度選擇常見的25 kGy。設置提取溫度分別為30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃，提取時間為48 h，按“2.1.1”項下方法制備供試液，進樣測試，記錄峰面積。以外標法計算提取液中bDtBPP含量，結果見表2。結果顯示30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃下bDtBPP提取量分別為0.16、0.23、0.42、0.70 μg/mL。結果顯示在30～60 ℃范圍內，bDtBPP提取量隨著溫度的增加而提高。

表2 不同提取溫度對bDtBPP提取量的影響

2.4.3 不同提取時間對bDtBPP提取量的影響

在提取試驗前采用伽瑪射線輻照對袋子進行處理，輻照強度選擇常見的25 kGy。設置提取溫度為40 ℃，分別于1、2、5、7、14和21天取樣，按“2.1.1”項制備供試液，進樣測試，記錄峰面積，以外標法計算提取液中bDtBPP含量，以提取時間(天)對應提取量作圖，結果見圖3。結果顯示1～7天內，bDtBPP的提取量迅速增加，7天后bDtBPP的提取量增加速度變慢。結果表明1～21天范圍內，bDtBPP的提取量隨著提取時間的增加而提高。

圖3 不同提取時間對bDtBPP提取量的影響

3 結 論

本研究采用高效液相色譜-質譜聯用技術(HPLC-MS/MS)測定提取液中抗氧劑168的降解物雙(2，4-雙叔丁基苯基)磷酸酯(bDtBPP)的含量。該方法具有高靈敏度和高選擇性，在0.13～20.16 μg/mL范圍內線性關系良好。本研究考察不同前處理條件和提取條件對bDtBPP可提取量的影響，探討影響其釋放行為的因素。

本研究結果顯示，采用未經輻照滅菌的樣品提取，提取液中未檢出bDtBPP，與文獻報道一致[7]，表明暴露于輻射是形成可提取bDtBPP的必要條件。抗氧化添加劑Irganox 168是聚烯烴配方中常用的輔助抗氧劑，作用是使聚合物在高溫加工或電離輻射過程中可能產生的過氧化氫失活[8]。在該過程中，Irganox 168被氧化生成Irganox 168磷酸鹽[9]，在輻照條件下，bDtBPP由Irganox 168磷酸鹽生成。

考慮到雙(2，4-雙叔丁基苯基)磷酸酯(bDtBPP)從一次性生物反應袋中溶出會對細胞生長產生顯著影響，本研究探索了影響其溶出速度的因素。可提取物的積累通常受熱力學與動力學因素控制[10]，溫度與時間是溶出的驅動力及關鍵影響因素。本研究結果表明隨著提取溫度升高，bDtBPP的提取量增加。同時，研究結果顯示，在40 ℃提取溫度下，隨著提取時間延長，bDtBPP的提取量增加，開始時增加速率較快，7天后增加速率減緩，14天后逐漸達到平衡。膜材與提取液中bDtBPP的最終平衡濃度受兩相(聚合物材料與液體)之間分配系數控制，假設膜材接觸層含一定量bDtBPP且不隨時間增加，則在最開始的提取時間段內，bDtBPP向袋子內液體的轉移速率較快，速率限制步驟為聚乙烯層擴散至聚乙烯/流體界面。隨時間推移，bDtBPP逐漸消耗，液體中累積量基本穩定。

一次性生物反應袋(SUBs)中的浸出物可能對最終制品產生潛在的毒性或抑制性影響。本研究結果為生物制藥過程中一次性使用系統的選擇與質量控制提供了重要參考。盡管本研究著重探討了(bDtBPP)對生物制藥過程的影響，但還需進一步研究評估其他可浸出物對生產過程與產品質量的影響。

綜上，本研究結果表明，溫度、時間和滅菌處理過程是影響bDtBPP從一次性生物反應袋中溶出的關鍵因素。