HPLC法測定注射用頭孢呋辛鈉有關物質方法的優化

＊陳仲祥 林美齡 尹可欣 熊莉平

（1.重慶工信職業學院 重慶 401233 2.西南藥業股份有限公司 重慶 400038）

注射用頭孢呋辛鈉為《中國藥典》[1]收載品種，根據2020年5月14日國家藥監局發布的關于開展化學藥品注射劑仿制藥質量和療效一致性評價工作的公告（2020年第62號）[2]，對其進行一致性評價。注射用頭孢呋辛鈉為原料藥無菌分裝制得，根據本品原料合成工藝路線可能引入雜質，對各國藥典（ChP2020、JP18、BP2020、EP10.0、進口注冊標準JX20170207）中提及雜質及本品穩定性試驗產生雜質進行分析，對本品雜質譜進行梳理，匯總本品可能存在雜質為：雜質A、雜質B、雜質C、雜質E、雜質F、雜質G、雜質H、雜質I、雜質8、雜質9及雜質11，對其進行研究。將上述可能產生或存在的雜質配制成系統適用性溶液篩選合適的方法，結果各國藥典方法均未能同時將上述雜質基線分離或雜質洗脫不完全。故在中國藥典方法上進行優化，延長了最終比例流動相的洗脫時間，更好地保證流動相的洗脫能力，取得理想的試驗結果，現報道如下。

1.材料

(1)主要儀器

XPR2電子天平（梅特勒）；ME204T/02電子天平（梅特勒）；XS105DU電子天平（梅特勒）；BT25S電子天平（賽多利斯）；KH-500DB數控超聲波清洗器（昆山禾創）；PB-10酸度計（賽多利斯）；LC-20AT高效液相色譜儀（島津）。

(2)試藥

注射用頭孢呋辛鈉（西南藥業股份有限公司，批號：Y200601，規格：1.5g）；西力欣（GSK，批號：PL7S，規格：0.75g）；頭孢呋辛對照品（中檢院，批號：130493-201706，純度：91.9%）；雜質A對照品（TLC，批號：2413-038A3，純度：95.9%）；雜質B對照品（TLC，批號：2469-088A5，純度：93.7%）；雜質C對照品（TLC，批號：2469-066A9，純度：97.4%）；雜質E對照品（QCC，批號：2469-066A9，純度：96.24%）；雜質F對照品（QCC，批號：18-SEP-18-12，純度：95.53%）；雜質G對照品（TLC，批號：3422-069A11，純度：95.2%）；雜質H對照品（TLC，批號：2277-014A4，純度：97.9%）；雜質I對照品（TLC，批號：2756-091A4，純度：96.8%）；雜質8對照品（TLC，批號：3278-001A2，純度：99.0%）；雜質9對照品（TLC，批號：3218-096A4，純度：97.5%）；雜質11對照品（TLC，批號：2405-090A2，純度：97.8%）；甲醇、乙腈為色譜純；冰醋酸、冰乙酸、三水合乙酸鈉等其余試劑均為分析純；水為超純水。

2.方法與結果

(1)色譜條件

色譜條件用辛烷基硅烷鍵合硅膠柱為填充劑（推薦Agilent Zorbax SB-C8柱，4.6mm×150mm，5μm或效能相當的色譜柱）；流動相A為醋酸鹽緩沖液（取醋酸鈉0.68g，冰醋酸5.8g，加水稀釋至1000mL，用冰醋酸調節pH值至3.4）；流動相B為乙腈；流速為每分鐘1.5mL，按表1進行線性梯度洗脫；檢測波長為273nm；柱溫為25℃；進樣體積20μL。

表1 有關物質梯度洗脫

(2)溶液的配制

溶劑：水。供試品溶液：含頭孢呋辛鈉約0.5mg/mL的溶液。

對照溶液：精密量取供試品溶液適量，用水定量稀釋制成每lmL中含1μg的溶液。

雜質儲備液：精密稱取雜質A、雜質B、雜質C、雜質E、雜質F、雜質G、雜質H、雜質I、雜質8、雜質9、雜質11對照品各適量，分別置10mL量瓶，加90%乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。

雜質定位溶液：分別精密量取上述雜質儲備液1mL，分別置不同的20mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。

雜質與樣品混合溶液：精密稱取頭孢呋辛對照品約5mg置50mL量瓶中，精密加入上述雜質母液：雜質A（0.8mL）、雜質B（0.8mL）、雜質C（0.4mL）、雜質E（0.8mL）、雜質F（0.9mL）、雜質G（0.8mL）、雜質H（0.8mL）、雜質I（0.2mL）、雜質8（0.4mL）、雜質9（1.0mL）、雜質11（0.2mL），加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質與樣品混合溶液。

(3)系統適用性試驗

精密量取稀釋劑、上述雜質定位溶液、雜質與樣品混合溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。見圖1，結果顯示各雜質能有效分離，空白溶劑不干擾測定，專屬性符合要求。

圖1 方法專屬性色譜圖

(4)檢測限和定量限

用溶劑逐步稀釋各已知雜質對照品儲備溶液，獲得的色譜圖中，信噪比約為10∶1時，確定為定量限；信噪比約為3∶1時，確定為檢測限。各雜質定量限遠低于控制限度要求，表明本方法能滿足雜質檢測靈敏度的要求，具體詳見表2。

表2 定量限和檢測限結果

續表

(5)線性和校正因子

在定量限到150%限度水平配制線性溶液進樣，以峰面積為縱坐標（y）、進樣質量濃度為橫坐標（x）進行線性回歸，并按以下公式計算校正因子，校正因子=頭孢呋辛線性方程的斜率/雜質線性方程的斜率。線性范圍和校正因子考察結果詳見表3。

表3 線性范圍和校正因子考察結果

(6)精密度

由試驗員A在A時間采用A儀器，平行測定6份供試品，作為重復性結果。由試驗員B在B時間采用B儀器平行測定6份供試品，合并重復性樣品共12份樣品作為精密度結果。12份RSD值評價不超過20%，精密度良好，結果詳見表4。

表4 精密度考察結果

未知雜質3 0.024 0.024 0.024 0.025 0.025 0.025 6 0.024 1.46 0.027 0.029 0.027 0.027 0.028 0.028 12 0.026 6.86未知雜質4 0.031 0.031 0.029 0.033 0.032 0.031 6 0.031 3.96 0.032 0.034 0.032 0.034 0.031 0.031 12 0.032 4.46雜質E 0.154 0.155 0.149 0.150 0.151 0.152 6 0.152 1.51 0.150 0.149 0.149 0.147 0.147 0.145 12 0.150 1.95雜質C 0.043 0.042 0.041 0.042 0.042 0.041 6 0.042 1.78 0.042 0.042 0.042 0.042 0.042 0.041 12 0.042 1.37未知雜質5 0.067 0.072 0.067 0.072 0.072 0.069 6 0.070 3.32 0.070 0.071 0.071 0.069 0.068 0.069 12 0.070 2.57雜質H 0.083 0.082 0.081 0.082 0.081 0.080 6 0.082 1.37 0.087 0.088 0.087 0.086 0.084 0.084 12 0.084 3.23未知雜質6 0.027 0.028 0.029 0.029 0.029 0.029 6 0.028 2.23 0.027 0.028 0.029 0.029 0.030 0.030 12 0.029 3.07

(7)加樣回收率

精密稱取注射用頭孢呋辛鈉（Y200601批，1.5g）內容物約12.5mg，置25mL量瓶，稱取9份，分別加入雜質限度50%、100%、150%的雜質對照溶液，加水稀釋至刻度，搖勻（臨用新制）；分別精密量取20μL，注入液相色譜儀。記錄色譜圖，平均加樣回收率在98.75%～109.1%范圍內，RSD在1.29%～4.81%范圍內，表明本方法準確度良好，詳見表5。

表5 回收率考察結果

(8)耐用性

耐用性實驗中對流速（±0.1mL/min）、柱溫（±2℃）、色譜柱批號、初始流動相比例（±2）、pH（±0.05）、波長（±2nm），微調色譜條件后，主峰與相鄰雜質峰分離度大于1.5，各相鄰雜質間均可有效分離；柱溫在23～25℃，樣品溶液中雜質檢出個數及檢出量基本一致，即建議柱溫控制在此溫度范圍內；流速在1.4～1.5mL/min時，樣品溶液中雜質檢出個數及檢出量基本一致，即建議流速控制在此范圍內；pH在3.35～3.40范圍內，樣品溶液中雜質檢出個數及檢出量基本一致，即建議流動相pH控制在此范圍內；有機相比例變動±2%、波長變動±2nm及更換不同批次色譜柱時，樣品溶液中雜質檢出個數及檢出量基本一致，上述各條件下方法均耐用。

表6 樣品中有關物質測定結果

(9)樣品測定

采用擬定標準測定6批自制樣品和1批參比制劑，均符合規定。結果詳見表6。

3.結論

圖2 樣品與雜質混合溶液在擬定條件、LC-MS/MS條件色譜圖

圖3 Y200601批加速6月樣品擬定條件、LC-MS/MS條件色譜圖

根據破壞性試驗、影響因素試驗和穩定性考察可知雜質A、雜質E、雜質H為降解雜質，其中有一雜質（RRT=0.3）在穩定性考察過程中增加超過0.2%，應對其進行鑒定和安全性評估。注射用頭孢呋辛鈉進口注冊標準中GSK1685761A雜質限度為不大于1.0%，標準中附有其結構式和分子量，此雜質對照品無法獲得，多方定制合成失敗。根據穩定性結果推測RRT=0.3處的雜質即為GSK1685761A雜質。對此雜質采用LC-MS/MS進行定性研究。將擬定條件中醋酸鈉更換為醋酸銨，其他色譜條件不變，作為MS條件。配制樣品與雜質混合溶液在擬定條件、上述MS條件下檢測，圖譜如圖2所示，將擬定條件流動相中醋酸鈉更換為醋酸銨后，樣品及各雜質保留時間基本一致。加速6月樣品Y200601批（0.75g，倒置）在擬定條件及MS條件下檢測，圖譜如圖3所示，說明更換緩沖鹽，樣品中雜質檢出一致。因此可在MS條件下對RRT0.3處的雜質進行定性分析。

對Y200601批（0.75g，倒置）加速6月樣品中RRT=0.3處雜質進行一級質譜、二級質譜研究。一級質譜解析預測分子量和分子式同GSK1685761A，二級質譜裂解示意圖顯示其裂解方式符合雜質GSK1685761A的結構特征。因此可以確定擬定條件下RRT=0.3的化合物為GSK1685761A。同進口注冊標準，將其限度定為1.0%。