大葉紫珠中萜類化合物的研究

石麗莉，鄭 蘇，單舒筠

(江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學(xué)校，江蘇 徐州 221116)

馬鞭草科紫珠屬植物大葉紫珠Callicarpa macrophylla Vahl，又名穿骨風(fēng)、假大艾、止血草、白背木、趕風(fēng)柴等，苗藥稱其為“豆嘎先”。其原植物為灌木，生于海拔110～2000 m的山坡路旁、疏林下或灌叢中，在我國廣東、廣西、海南、貴州、云南等省區(qū)均有出產(chǎn)，是一種野生的常用中草藥。其味辛、苦，性平，歸肝、肺、胃經(jīng)，具有散瘀止血，消腫止痛之功效，主治衄血，咯血，吐血，便血，外傷出血，跌撲腫痛等癥[1]。民間習(xí)用大葉紫珠根、枝、葉入藥，鮮用或曬干；2010版藥典將大葉紫珠作為新增品種收錄記載，夏秋兩季采摘其葉或帶葉嫩枝，曬干入藥?，F(xiàn)代學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，大葉紫珠中含黃酮類、萜類、苯丙素類、甾體類等多種類型的化合物[2-5]，特別是萜類成分的細(xì)胞毒活性在抗癌方面顯示其明顯的治療效果[3-6]，具有很高的藥用價值。為了更深入闡明大葉紫珠中萜類成分的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本實驗著重對大葉紫珠乙醇超聲提取物進行了較系統(tǒng)的研究，從中分離鑒定出6個萜類化合物，分別為urs-12-en-3β-ol(1)、Oleanic acid(2)、14α,18-dihydroxy-7,15-isopimaradiene(3)、isopimaradiene-3β,18-diol(4)、3β-ace-toxy-urs-12-ene-11-one-12-ol(5)、ent-7α,16β,17,18-tetrahydrox-ykaur-15-one(6)。

1 儀器與材料

Bruker-DRX-600型核磁共振儀(瑞士Bruker公司)；Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)，四元泵，DAD檢測器，Agilent Chemstation色譜工作站(美國Agilent公司)；Buchi R-114旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦有限公司)；SK250HP超聲波提取器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；Combi Flash Rf 200中低壓快速分離色譜儀(美國Teledyne科技有限公司)；制備型HPLC(Shimadzu,Tokyo,日本)：泵Shimadzu LC-20AR、檢測器Shimadzu SPD-20A、色譜柱Shim-pack RP-C18 column (10 μm, 200×20 mm)；中壓色譜分離凝膠MCI(德國Merck公司)；薄層層析硅膠板HSGF254，GF254(青島海洋化工有限公司)；凝膠柱層析Sephadex LH-20(美國GE公司)；柱層析填料硅膠(100～200目，青島海洋化工有限公司)；HPLC分析使用色譜純試劑，硅膠柱色譜洗脫等使用分析純試劑。

2 提取與分離

稱取大葉紫珠干燥葉5 kg，以適量95%乙醇超聲提取2次，3 h/次，合并兩次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至流浸膏，加水混懸。將混懸液依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取2～3次，將各溶劑層萃取液合并，回收溶劑，濃縮至浸膏狀，真空干燥后記錄各萃取層所得膏體的收率如下：石油醚層為2.9%、二氯甲烷層為50.5%、乙酸乙酯層為3.4%、正丁醇層為22.1%。取二氯甲烷萃取部位，采用常壓硅膠柱色譜進行分離，依次用石油醚∶乙酸乙酯(100∶1→50∶1→30∶1→15∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1→1∶5)和乙酸乙酯梯度洗脫，TLC檢測，合并相同Rf值的流分，得23個組分(Fr.1～Fr.23)。Fr.3有大量物質(zhì)在甲醇中難溶，過濾得到化合物1(119.6 mg)。Fr.11經(jīng)中低壓快速分離色譜硅膠柱色譜(二氯甲烷∶甲醇，80∶1→1∶1)梯度洗脫后，得到5個組分(Fr.11-1～Fr.11-5)；Fr.11-2(73.1 mg) 經(jīng)凝膠柱層析，二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫得化合物2(49.3 mg)。Fr.20經(jīng)中低壓快速分離色譜C18柱色譜(甲醇-水，20%～100%)梯度洗脫后，得到7個組分(Fr.20-1～Fr.20-7)，F(xiàn)r.20-5 (124.8 mg) 經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，甲醇洗脫得6個組分(Fr.20-5-1～Fr.20-5-6)；Fr.20-5-3(21.4 mg)經(jīng)制備液相(波長203 nm；甲醇-水，62∶36；流速3 mL/min)得化合物3(8.2 mg)、化合物4(6.7 mg)。取乙酸乙酯萃取部位，經(jīng)中低壓快速分離硅膠柱色譜(二氯甲烷：甲醇，100∶1→1∶80)梯度洗脫后，得到9個組分(Fr.1～Fr.9)。Fr.3經(jīng)中壓色譜分離凝膠MCI，甲醇梯度洗脫后，在丙酮中重結(jié)晶得化合物5(10.8 mg)。Fr.8經(jīng)中低壓快速分離C18柱色譜(甲醇∶水，3∶7)洗脫得3個組分(Fr.8-1～Fr.8-3)，F(xiàn)r.8-1在丙酮中重結(jié)晶得化合物6(10.2 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

3.1 化合物 1

該化合物為白色絲狀晶體 (二氯甲烷), 醋酸酐-濃硫酸反應(yīng)呈陽性 。1H-NMR(600 MHz, DMSO-d6)譜給出 1個烯氫信號δ5.12(1H, m, H-12), 且為環(huán)內(nèi)雙鍵；1個連氧叔碳原子上的氫信號δ2.46 (1H, m, H-3);6個甲基單峰氫信號δ：0.77(s，CH3)，0.80(s，CH3)，1.07(s，CH3)，1.25(s，CH3)，4.28(s，CH3)，5.08(s，CH3)和兩個甲基雙峰信號δ0.93(3H，d，J=6.0 Hz)，δ0.87(3H，d，J=6.0 Hz)。13C-NMR(151 MHz, DMSO-d6)譜給出1個連氧碳信號δ77.3(C-3);2個烯碳信號δ145.2 (C-13)，δ124.5(C-12)，表明該化合物為烏蘇 -12-烯型五環(huán)三萜。13C-NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ：58.9(C-18)，55.2(C-5)，47.6(C-9)，42.0(C-14)，41.4(C-22)， 40.0 (C-8)，38.8(C-19, 20)，36.8(C-1)，36.4 (C-4)，34.9 (C-10)，33.8 (C-17)，32.9(C-7)，31.2(C-21)，28.9(C-15)，28.6 (C-23)，28.0 (C-28)，27.4(C-2)，26.6 (C-16)，23.5(C-11)，23.4 (C-30)，21.7(C-27)，18.4(C-6)，17.8(C-29)，17.0(C-26)，16.5(C-25)，15.9(C-24)。13C-NMR譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7-9,18]報道的數(shù)據(jù)基本一致,故鑒定化合物1為urs-12-en-3β-ol(烏蘇-12-烯-3β-醇)。

圖1化合物11H-NMR譜圖 圖2化合物113C-NMR譜圖

3.2 化合物 2

該化合物為白色粉末狀固體。1H-NMR(600 MHz, CH3OH+D2O) (圖3)給出 1個連氧原子上的氫信號δ5.64(C12-H)，1個羧基上的氫信號δ5.24(C3-OH)，7個甲基單峰氫信號δ：0.94(s，CH3)，0.97(s，CH3)，1.01(s，CH3)，1.07(s，CH3)，1.09(s，CH3)，1.53(s，CH3)，1.55(s，CH3)。13C-NMR (151 MHz, CH3OH+D2O) (圖4)給出1個羧基碳信號δ180.0(C-28)，1個連甲氧基碳信號δ23.9(C-3)，其余碳信號δ：15.8(C-25)，16.3(C-24)，17.7(C-26)，19.5(C-6)，23.6(C-30)，23.9(C-11，16)，24.0(C-27)，24.5(C-2)，26.3(C-15)，27.8(C-23)，28.7(C-20)，31.6(C-7，22，29)，33.5(C-21)，33.8(C-10)，34.9(C-1)，38.1(C-4)，39.8(C-8)，42.7(C-18)，42.8(C-14)，46.6(C-17)，47.6(C-19)，47.9(C-9)，56.7(C-5)，79.7(C-3)，123.6(C-12)，145.2(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道[8,10-12]基本一致，故化合物2鑒定為oleanolic acid(齊墩果酸)。

圖3化合物21H-NMR譜圖 圖4化合物213C-NMR譜圖

3.3 化合物 3

該化合物為白色片狀晶體。13C-NMR (151 MHz, CdCl3)與1H-NMR(600 MHz, CdCl3)譜數(shù)據(jù)見表1，與文獻(xiàn)[13-19]報道的數(shù)據(jù)基本一致，鑒定該化合物為14α,18-dihydroxy-7,15-isopimaradiene(14α,18-二羥基-7,15-異海松二烯)。

3.4 化合物 4

該化合物為白色片狀晶體。13C-NMR (151 MHz, CdCl3)與1H-NMR(600 MHz, CdCl3)譜數(shù)據(jù)見表1，與文獻(xiàn)[13-19]報道的數(shù)據(jù)基本一致，鑒定該化合物為isopimaradiene-3β,18-diol(異海松二烯-3β,18-二醇)。

表1 化合物3、4 1H-NMR(600 MHz, CdCl3)與13C-NMR (151 MHz, CdCl3)數(shù)據(jù)

表1(續(xù))

3.5 化合物 5

該化合物為白色晶體。1H-NMR(600 MHz, CH3OH+D2O)譜給出7個甲基單峰氫信號δ：0.83(s，CH3)，1.17(s，CH3)，1.18(s，CH3)，1.35(s，CH3)，1.57(s，CH3)，0.88(s，CH3)，0.89(s，CH3)和兩個甲基雙峰信號δ0.81(3H, d,J=6.5 Hz)，δ0.93(3H, d,J=6.5 Hz)。13C-NMR (151 MHz, CH3OH+D2O)譜圖顯示了32個碳信號，經(jīng)無畸變極化轉(zhuǎn)移增強(DEPT)譜進一步分析，將32個碳分類為9個非質(zhì)子化碳，6個次甲基，8個亞甲基和9個甲基碳。其中氫信號δ2.05與碳信號δ20.9，δ170.8表明化合物結(jié)構(gòu)中存在一個乙酰氧基；碳信號δ195.3推斷化合物結(jié)構(gòu)中存在一個酮基；碳信號δ144.5，δ134.4推斷化合物結(jié)構(gòu)中有一個雙鍵。綜合上述證據(jù)確證化合物5是一個含有乙酰氧基的三萜類化合物。對比查閱文獻(xiàn)，13C-NMR譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18,20-22]報道，化合物5確證為3β-ace-toxy-urs-12-ene-11-one-12-ol (3β-乙酰氧基-urs-12-烯-11-酮-12-醇)。

3.6 化合物 6

該化合物為白色晶體。1H-NMR(600 MHz, CdCl3)譜給出2個甲基單峰氫信號δ：0.66(s，CH3)，1.02(s，CH3)；一個含氧次甲基的寬雙峰氫質(zhì)子信號δ3.66(dd，J=10.5，5.5 Hz) ；2個含氧亞甲基雙重峰信號δ2.85/3.18與δ3.45/3.54；其余氫質(zhì)子信號介于 0.93～4.78 ppm之間。13C-NMR (151 MHz,CdCl3)譜圖顯示該化合物20個碳原子的信號，經(jīng)無畸變極化轉(zhuǎn)移增強(DEPT)譜深入分析，碳信號δ219.2推斷該化合物結(jié)構(gòu)中有一個酮基；碳信號δ69.5推斷化合物結(jié)構(gòu)中有一個氧代次甲基； 碳信號δ61.3與δ69.7表明結(jié)構(gòu)中含有兩個含氧亞甲基；碳信號δ17.2與δ17.5表明結(jié)構(gòu)中含有2個甲基；碳信號δ36.9,δ38.3,δ58.5和δ79.1處推斷為結(jié)構(gòu)中的4個季碳；除此之外，結(jié)構(gòu)中還推論含有六個亞甲基，三個次甲基和四個羥基。綜合上述分析結(jié)果，化合物6是一個二萜類化合物，查閱參考文獻(xiàn)[8,14,20-24]，相應(yīng)數(shù)據(jù)進行比對，基本完成1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)的歸屬，確證化合物6為ent-7α,16β,17,18-tetrahydrox-ykaur-15-one (ent-7α,16β,17,18-四氫甲苯-貝殼杉烷-15-酮)。

4 結(jié)論

通過對大葉紫珠Callicarpa macrophylla Vahl乙醇超聲提取物的系統(tǒng)研究，分別自二氯甲烷及乙酸乙酯萃取物中分離得到六個萜類化合物(1～6)，并鑒定確證其骨架構(gòu)型。六個萜類化合物結(jié)構(gòu)式如下：

天然藥物化學(xué)和生物學(xué)研究表明，中藥材大葉紫珠中含黃酮類、萜類、苯丙素類、甾體類等多種類型的化合物。其中，萜類及其苷類的細(xì)胞毒活性在抗癌方面的治療效果，具有很高的藥用價值[2-5,14,20-22]。為了更深入闡明大葉紫珠中萜類物質(zhì)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本實驗綜合運用傳統(tǒng)與現(xiàn)代化的分離純化手段，以中低壓快速分離色譜為主，多種色譜方法相結(jié)合，創(chuàng)建了一個快速、高效對大葉紫珠乙醇超聲提取物系統(tǒng)研究的流程，以期在實踐應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)更多大葉紫珠中含有的藥效物質(zhì)成分。