3種有機溶劑對普通小球藻生長特性的影響

張 恒,鐘 波*,張世林,李立杰

(1.湖北省水產產業技術研究院,湖北荊州 434020；2.長江大學濕地生態與農業利用教育部工程研究中心,湖北荊州434025；3.長江大學動物科學學院,湖北荊州434025)

有機溶劑是以有機物為介質,具有脂溶性和揮發性的有機化學物質[1]。在環境污染物的水生態風險評價試驗中,尤其是暴露于疏水性典型環境有機污染物的毒性試驗,有機溶劑的使用更為普遍[2]。有機溶劑也具有一定的毒性,如對皮膚的原發性刺激、對中樞神經系統的非特異性抑制以及對周圍神經系統、肺和心臟的特異性作用等[3],在有有機溶劑使用的毒理學試驗中,對試驗對象的毒性效應應該重視,因此毒理學試驗中有機溶劑的種類選擇及其濃度設置顯得尤為重要。

浮游植物(主要是微藻)的多樣性和生物量直接影響著水生生態系統的結構和功能,對水環境的平衡和穩定起著極其重要的作用[4]。大多數微藻體積小,繁殖快,適應性強,對有毒物質敏感。近年來,藻類作為水環境指示生物已被廣泛應用于水安全評價和環境毒物檢測中[5]。普通小球藻(Chlorellavulgaris)屬綠藻門(Chorophyta)小球藻科(Chlorellaceae)小球藻屬(Chlorella)[6],分布廣泛,可大量繁殖形成水華,也是多污染區和中等污染區的指示生物,是一種理想的化學物質毒性受試生物[7]。該研究以普通小球藻為研究對象,分別進行3種常見有機溶劑[二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、乙醇(ethanol)、丙酮(acetone)]對其的單一毒性效應,分析并比較對其生長特性的影響,為有機溶劑在藻類毒理學研究中的應用提供基礎數據和參考方法。

1 材料與方法

1.1 溶劑丙酮和乙醇購自天津市北聯精細化學品開發有限公司,二甲基亞砜購自天津市科密歐化學試劑有限公司，這3種有機溶劑的基本性質如表1所示。

表1 3種有機溶劑的基本性質Table 1 Basic properties of three organic solvents

1.2 藻種及其培養普通小球藻購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫。

采用BG11培養液培養,接種培養液高壓滅菌,取處于對數生長期的藻種進行接種,接種藻密度為1.0×105～1.5×105cells/mL(初始OD680為0.017～0.021)。培養條件:溫度為25 ℃,光暗比為12 h∶12 h,光強為5 000 lx左右。丙酮、乙醇、二甲基亞砜體積分數分別為0.01%、0.05%、0.10%、0.50%、2.00%、5.00%,每組設3個重復,并設不加有機溶劑空白對照組(CK),藻液體積共300 mL,靜置培養,每天定時人工搖瓶3～4次。

1.3 藻類生長效應的測定每隔24 h使用紫外-可見光分光光度計,于680 nm處檢測各處理組和對照組藻培養液的光密度,連續檢測8 d。利用預先測定的藻細胞密度與光密度的標準曲線計算試驗樣本中藻細胞密度，公式如下:

Y=84.893 1X-0.336 1(R2=1)

(1)

式中,Y為藻密度(×105cells/mL)；X為680 nm處的光密度。

1.4 比生長速率測定比生長速率(specific growth rate,SGR)[8]按一般生物學計算公式計算,公式如下:

K=(lnN2-lnN1)/(t2-t1)

(2)

式中,K為比生長速率(d-1)；N2為t2的藻密度(cells/mL)；N1為t1的藻密度(cells/mL)；t代表生長時間(d)。

1.5 葉綠素a含量的測定取10 mL藻液借助抽濾裝置通過0.45 μm醋酸纖維膜,真空泵壓泵的壓力維持在0.05 MPa,膜上多余水分抽干,將濾膜剪碎后放入加有10 mL 90%乙醇溶液的旋口刻度管中,75 ℃水浴鍋中提取5 min,對其提取液進行測定,用分光光度計讀取其665和750 nm處的光密度。再向提取液加入1～2滴l mol/L鹽酸,酸化8 min后再次讀取其665和750 nm處的光密度。根據公式(3)計算出原藻液中各葉綠素a的含量:

C(chl-a)=27.3(Ea-Eb)ve/v

(3)

式中,C(chl-a)為葉綠素a含量(μg/L)；Ea為提取液酸化前波長665和750 nm處的光密度之差,Eb為提取液酸化后波長665和750 nm處的光密度之差,ve為乙醇提取液的體積(mL),v為抽濾的水樣體積(L)[9]。

1.6 溶劑NOEC值的測定利用藻類生長曲線,通過方差分析,與對照組沒有顯著差異的最高體積分數,可以認為是最大無影響體積分數(NOEC)。

1.7 數據處理采用Origin 8.0進行數據的圖表分析,采用SPSS 20.0軟件進行相關性分析。試驗數據以平均值±標準差(Mean±SD)表示。采用單因素方差分析(ANOVA)進行分析,事后檢驗采用Duncan方法或Dunnett’s C test對各試驗組與對照組的數據進行比較。

2 結果與分析

2.1 3種有機溶劑對普通小球藻藻密度的影響由圖1可知，當二甲基亞砜體積分數為0.01%～0.10%時,普通小球藻藻密度與空白對照相比無顯著差異；而在體積分數0.50%～5.00%時開始表現出對藻細胞具有抑制作用,抑制率最高達61.90%,二甲基亞砜對普通小球藻NOEC為0.10%。當丙酮和乙醇體積分數為0.01%～2.00%時,對藻細胞表現出較明顯的促進作用,最大促進率分別為444.84%和480.55%；當體積分數均為5.00%時,對藻細胞抑制作用明顯,抑制率分別為78.78%和74.67%,丙酮和乙醇對普通小球藻NOEC值均為0.01%，表現出低濃度促進高濃度抑制的作用。

圖1 3種有機溶劑對普通小球藻藻密度的影響Fig.1 Effects of three organic solvents on the density of Chlorella vulgaris

由表2可知,當二甲基亞砜體積分數0.01%～0.10%時,藻密度和比生長速率均與對照組相比差異不顯著(P>0.05),其中最高藻密度4.015×105cells/mL對應的體積分數是0.05%,最高比生長速率(0.250 d-1)對應的體積分數是0.10%。乙醇和丙酮對藻密度和比生長速率的影響均呈先上升后下降的趨勢,體積分數0.01%～2.00%與對照組相比增幅顯著,體積分數5.00%時比生長速率有負值出現,呈負增長。

表2 3種有機溶劑對普通小球藻平均藻密度和比生長速率的影響Table 2 Effects of three organic solvents on the average algal density and growth rate of Chlorella vulgis

由表3可知,3種有機溶劑在體積分數較低時普通小球藻的生長狀況符合二次方程的相關性。二甲基亞砜體積分數0.01%～0.10%時,方程系數a為正值,拋物線開口向上；丙酮、乙醇體積分數0.01%～2.00%時回歸方程系數a均大于對照組,與藻密度變化趨勢相同。當二甲基亞砜體積分數0.50%～5.00%,乙醇、丙酮體積分數5.00%時回歸方程發生實質性改變,方程次數由二次增加為五次、六次。

表3 不同有機溶劑體積分數對普通小球藻藻密度影響與時間之間的相關性Table 3 Correlation between time and the effect of volume fraction of different organic solvents on the algal density of Chlorella vulgaris

2.2 3種有機溶劑對普通小球藻葉綠素a含量的影響試驗結束測定各處理組葉綠素a含量,由圖2可知,二甲基亞砜體積分數為0.01%～0.10%時,葉綠素a含量與對照組相比無顯著差異；體積分數為0.50%～5.00%時,葉綠素a含量顯著下降,最高抑制率達91.56%。乙醇和丙酮對葉綠素a含量的影響總體上呈先上升后下降的趨勢,丙酮體積分數為0.05%～2.00%、乙醇體積分數為0.05%～0.10%時,藻細胞中葉綠素a含量顯著上升；乙醇和丙酮體積分數為5.00%時均對葉綠素a含量抑制作用明顯,抑制率分別為90.12%和88.88%。

圖2 3種有機溶劑對普通小球藻葉綠素a含量的影響Fig.2 Effect of three organic solvents on chlorophyll-a content in Chlorella vulgis

3 討論與結論

在生態毒理學試驗中,典型疏水性環境污染物(多溴聯苯醚、有機氯農藥、多環芳烴等)通常需要添加有機溶劑或表面活性劑來提高溶解度,如丙酮、二甲基亞砜、吐溫-80等,其中吐溫-80等表面活性劑,與細胞膜相互作用,增加污染物的溶解度,低濃度對生物主體的傷害也較大[10]。而很多有機溶劑本身也有毒性,如神經毒性、血液毒性、肝臟毒性等[11]。因此,有機溶劑的種類和濃度的選擇尤為重要，既要保證污染物的溶解性,又不與污染物發生反應,同時對受試生物的毒性很小。目前文獻中關于二甲基亞砜或丙酮等有機溶劑用量的結論并不一致,如向昆侖等[12]以1%二甲基亞砜作為青島大扁藻安全濃度；王擺等[13]以0.1%二甲基亞砜為球等鞭金藻和新月菱形藻無影響濃度；劉帥等[14]以1%丙酮為蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)幼體安全添加濃度；薛俊欣等[15]研究表明DMSO、二甲基甲酰胺、甲醇和乙醇對弓形蟲增殖的安全添加濃度分別為1.0%、0.1%、1.0%和0.1%。造成差異的主要原因是有機溶劑的種類、生產廠家、純度以及對受試對象敏感性的不同。

不同生物對同一種有機溶劑的敏感性不同,同一生物對不同有機溶劑的敏感性也不同[16]。藻類作為主要的水域初級生產者,也是水體中重要的生物環境,通常對有機質和其他污染物均表現出較強的敏感性,是水域生態系統健康評價典型的指示生物,廣泛應用于各種生態學試驗[17]。但由于藻類對環境因子的敏感性,在以藻類尤其微藻為受試生物的毒理學試驗中,有機溶劑的使用是否對藻類產生毒性效應從而影響試驗結果,應該值得重視。該試驗結果顯示,二甲基亞砜體積分數0.50%～5.00%時對普通小球藻的抑制作用明顯,抑制率達61.90%；丙酮和乙醇體積分數均為5.00%時,抑制作用明顯，抑制率分別為78.78%和74.67%。鄭培忠等[18]研究發現丙酮高濃度(10%)對固氮藍藻抑制率達92%；李玲等[19]研究表明丙酮體積分數為5.000 0%的小球藻和丙酮體積分數為0.500 0%～5.000 0%的水華微囊藻,葉綠素a顯著降低,抑制率分別為88.2%和99.7%,導致藻類生長嚴重抑制甚至死亡。有機溶劑除對藻類以外的受試生物也有明顯的毒性效應,邸亞男等[20]研究發現乙醇、異丙醇、丙酮和二甲基亞砜4種有機溶劑對斑馬魚胚胎發育均出現了不同程度形態變化，如心包水腫、出血、卵黃缺損和身體彎曲等,以DMSO致畸作用最嚴重。黃毅等[21]研究發現有機溶劑甲醇、乙醇、乙二醇、異丙醇對黃鱔堿性磷酸酶(ALP)均有一定抑制作用,其抑制作用強弱順序為異丙醇>乙醇>甲醇>乙二醇。其毒性機理可能是有機溶劑作用于細胞膜中的磷脂雙分子層或中間的蛋白層,改變膜的流動性和滲透性,導致質子和離子的滲透性突然增大,破壞細胞膜的完整性,有毒物質直接進入細胞與某些生命活動物質發生反應,導致細胞正常新陳代謝失衡,甚至死亡[22]。

該試驗低濃度丙酮和乙醇(0.01%～2.00%)對普通小球藻生長有刺激效應,葉綠素a含量顯著上升。藻細胞葉綠素的增強有利于減輕環境脅迫對光合作用的抑制,從而改善和提高藻類的光合能力,進行物質積累,最終顯著促進藻細胞的生長[23],所以低濃度丙酮和乙醇(0.01%～2.00%)處理組的藻細胞表現出與對照相比更為優異的生長趨勢,這種現狀稱為毒性興奮效應[24]。一方面可能是有機化合物作為附加碳源或誘導劑刺激藻細胞的生長,也可能是誘導了部分基因的表達,增加了相應功能蛋白、胞內核酸和酶含量,抵抗了有機化合物的毒害[25]。另一方面細胞存在一定的特異性耐受機制,包括細胞膜耐受機制[26]、細胞膜上的溶劑泵出機制[27]、細胞內的有機溶劑轉化和降解機制[28]等,能使細胞內有機溶劑的含量低于致死閾值,從而具有一定的耐受性。張磊等[29]研究發現低濃度(0.001和0.010 mg/L)草甘膦異丙銨鹽顯著促進球形棕囊藻的生長,SOD和CAT活性等生理指標有明顯的刺激效應；唐學璽等[30]研究表明低濃度的對硫磷(≤1.5 mg/L)對三角褐指藻的生長有刺激作用,顯著促進藻細胞蛋白質、DNA和RNA的合成；張鶯臍等[31]研究表明氟苯尼考濃度低于1 mg/L時促進球等鞭金藻的生長和光合速率色素含量顯著增加；張哲等[32]研究表明低劑量組 (5、10、15 mg/L)草甘膦能顯著促進旋鏈角毛藻(Chaetoceroscurvisetus) 和鹽生杜氏藻 (Dunalleliasalina)的生長。