新疆山羊皮膚組織中MC1R·Agouti和MITF基因的差異表達研究

許艷麗，呂雪峰，柴 婷，賽迪古麗，胡 昕，王 樂

(新疆畜牧科學院畜牧業質量標準研究所，新疆烏魯木齊 830012)

新疆山羊是我國絨肉兼用型地方山羊品種，在新疆各地均有分布，其中心產區為東疆的哈密。新疆山羊絨毛品質優良且具有較好的產肉性能，在新疆畜禽種質資源中占有重要的地位。山羊絨是我國具有重要經濟價值的毛絨資源之一，享有“軟黃金”的美譽。毛色是絨山羊的一個重要生產性狀，可作為重要的遺傳標記，用于分子育種，是決定山羊絨經濟價值的主要因素之一。新疆山羊被毛以白色為主，褐色和黑色次之。白色有利于毛紡業加工，更受消費者的青睞。哺乳動物毛色的形成受多個基因的作用，同時也受外界環境的影響。在黑色素形成的信號通路中黑色素皮質受體-1基因(MC1R)、酪氨酸酶基因(TYR)、刺鼠信號蛋白基因(Agouti)、肥大/干細胞生長因子受體基因(KIT)、小眼畸形相關轉錄因子(MITF)等對毛色形成發揮著重要的作用[1]。近年來，對動物毛色候選基因的研究很多，但有關新疆山羊毛色基因的研究較少。筆者以新疆山羊MC1R、Agouti和MITF基因為研究對象，采用qRT-PCR分析其mRNA在不同毛色新疆山羊皮膚組織中的差異表達，分析3個毛色基因與新疆山羊毛色的關系，為深入研究MC1R、Agouti和MITF基因對毛色形成的作用提供理論依據，為通過毛色選擇開展新疆山羊的選育擴繁奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗樣品。在新疆塔城地區和布克賽爾牧場選取不同毛色(白色、褐色、黑色)成年新疆山羊各3只，使用皮膚取樣器進行皮膚樣品采集，置于凍存管中液氮保存備用。

1.1.2主要試劑及儀器。

1.1.2.1主要試劑。TRIzolTMReagent(ambion)、5×All-In-One RT MasterMix(ambion)、EvaGreen Express 2×qPCR Master Mix-Low Rox(ambion)、M5 HiClear DL2000 DNA marker(聚合美)。

1.1.2.2主要儀器。高速冷凍離心機(Thermo Fisher，美國)；Real Time PCR instrument(ABI，美國)；電泳槽(北京六一)；凝膠成像系統(上海天能)；微量分光光度計(杭州奧盛)。

1.2 方法

1.2.1RNA提取及反轉錄。將采集的皮膚組織液氮研磨，采用Trizol法提取不同毛色新疆山羊皮膚組織總RNA，使用微量分光光度計檢測RNA濃度，再利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。按照5× All-In-One RT MasterMix反轉錄試劑盒步驟說明書進行反轉錄，-20 ℃下保存反轉錄產物。

1.2.2主要儀器。引物設計與合成。依據NCBI網站上已公布的MC1R、Agouti和MITF基因序列，利用 Primer Premier 5.0 軟件進行定量引物設計，選用GAPDH基因作為內參基因，引物序列見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列 Table 1 The sequences of the primers

1.2.3實時熒光定量PCR(qRT-PCR)。以獲得的cDNA為模板，參照 EvaGreen Express 2×qPCR Master Mix-Low Rox試劑盒說明書建立PCR反應體系(20.0 μL)：cDNA模板2.0 μL，擴增基因上下游引物各 0.6 μL，Evagreen 2×qPCR Master Mix 10.0 μL，RNase-free Water 6.8 μL。PCR反應程序：預變性95 ℃ 3 min；變性95 ℃ 5 s，退火/延伸60 ℃ 30 s，共40個循環。

1.2.4數據統計與分析。目的基因相對表達水平采用2-ΔΔCt方法計算，運用SPSS 19.0統計軟件對各組目的基因mRNA相對表達量進行統計分析，采用單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 RNA提取使用微量分光光度計檢測樣本總RNA濃度和純度，測得A260/A280為1.8～2.0。RNA經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測發現條帶整齊、完整、清晰，無嚴重拖尾(圖1)，可用于后續反轉錄。

圖1 RNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Electrophoretogram map of RNA agarose gel

2.2 不同毛色新疆山羊皮膚組織中MC1R、Agouti、MITF基因mRNA的表達分析實時熒光定量PCR(qRT-PCR)結果表明，MC1R、Agouti及MITF基因mRNA 在不同毛色的新疆山羊皮膚組織中均有表達。MC1R基因 mRNA在黑色新疆山羊皮膚組織中表達量最高，見圖2；Agouti基因mRNA在白色新疆山羊皮膚組織中的表達量顯著高于褐色和黑色山羊(P<0.05)，褐色和黑色山羊皮膚組織中Agouti基因mRNA表達量差異不顯著(P>0.05)(圖3)；MITF基因mRNA在黑色新疆山羊皮膚組織中的表達量高于其他毛色(P>0.05)，見圖4。

圖2 MC1R基因mRNA在不同毛色新疆山羊皮膚組織中的相對表達量Fig.2 The expression quantity of MC1R mRNA in the skin tissues of Xinjiang goats with different coat colors

圖3 Agouti基因mRNA在不同毛色新疆山羊皮膚組織中的相對表達量 Fig.3 The expression quantity of Agouti mRNA in the skin tissues of Xinjiang goats with different coat colors

圖4 MITF基因mRNA在不同毛色新疆山羊皮膚組織中的相對表達量Fig.4 The expression quantity of MITF mRNA in the skin tissues of Xinjiang goats with different coat colors

3 討論

動物毛色主要由黑色素細胞產生的真黑素和褐黑素數量和分布決定，二者不同的含量和比例形成不同的毛色[2]。

MC1R基因是控制動物毛色的重要候選基因之一，在調控黑色素合成方面發揮著重要的作用，主要在毛囊和皮膚黑色素細胞中表達[2-3]，其表達影響黑色素細胞中真黑素的形成，大量MC1R基因表達會使動物呈黑色或褐色的毛色表型[4]。在綿羊[5-6]、羊駝[7]、牦牛[8]等動物皮膚組織中發現，MC1R基因mRNA在深色群體皮膚組織中的表達量均高于淺色群體。李洪濤等[9-10]研究發現MC1R基因是控制哈薩克羊被毛黑色的主效基因，哈薩克羊MC1R基因突變與黑色被毛呈極顯著相關。大量研究表明，MC1R基因與動物的毛色性狀表現相關。該研究結果表明，MC1R基因在黑色新疆山羊皮膚中的mRNA表達量最高，高于褐色和白色新疆山羊。這與景炅婕等[11]、蔣婧等[12]深色山羊群體皮膚組織中MC1R基因mRNA表達量高于淺色群體的研究結果相一致。

Agouti基因是調節哺乳動物毛色的基因之一，編碼信號蛋白ASIP。該信號蛋白可以降低真黑素的合成，從而促進褐黑素的合成[13]。Agouti基因還可以通過抑制MITF的表達，降低酪氨酸酶活性，從而合成褐黑色素[14]。薛麗娜等[15-16]研究發現Agouti基因外顯子的單核苷酸突變多態性與綿羊被毛毛色不相關，說明Agouti基因可能不是控制綿羊被毛顏色的主效基因。杜楠[17]研究表明渝東白山羊各個組織中的ASIP基因表達水平極顯著高于酉州烏羊(P<0.05)。該試驗中白色新疆山羊Agouti基因的mRNA表達水平最高，顯著高于褐色和黑色新疆山羊(P<0.05)，說明Agouti基因在新疆山羊毛色形成過程中發揮作用，但是否為控制新疆山羊毛色的主效基因還有待深入研究。

小眼畸形相關轉錄因子(MITF)是色素細胞信號轉導途徑下游的信號分子，通過調控酪氨酸基因家族的表達參與黑色素的合成[18]。劉錚錚[19]研究表明，人類MITF基因突變引起 Waardenburg 綜合征 2A 型(WS2A)，典型癥狀表現為先天性白內障和神經性耳聾。張建一[20]研究發現黑色牦牛皮膚中MITF基因mRNA相對表達量顯著高于白色牦牛，說明牦牛白色被毛和黑色被毛性狀可能與MITF基因在皮膚組織中mRNA的表達量有關。該試驗中MITF基因 mRNA 在黑色新疆山羊皮膚中的表達量高于褐色和白色山羊，說明在一定程度上MITF基因可能參與了新疆山羊毛色的形成。

該試驗結果表明，MC1R、Agouti和MITF基因在不同毛色新疆山羊皮膚組織中均有表達。MC1R、MITF基因mRNA在黑色新疆山羊皮膚組織中的表達量最高，其在白色新疆山羊皮膚組織中的表達量最低；不同毛色新疆山羊皮膚組織中Agouti基因mRNA的表達量高低順序為白色>褐色>黑色。以上結果表明毛色候選基因MC1R、Agouti和MITF基因在一定程度上參與了新疆山羊黑色素生成和沉積。由于毛色是多個基因共同作用的結果，毛色基因MC1R、Agouti和MITF與新疆山羊毛色的相關性還有待進一步探究。