基于網絡藥理學及分子對接探究茵梔黃顆粒治療肝纖維化的作用機制

申鳳霞，范建偉，李倩，馬云，馮群，關永霞*

(1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.魯南制藥集團股份有限公司 中藥制藥共性技術國家重點實驗室， 山東 臨沂 276006；3.山東新時代藥業有限公司，山東 臨沂 273400)

肝纖維化是肝臟結締組織異常增生，這些結締組織增生是由肝炎所導致的肝細胞的損傷所致。當纖維化達到一定程度，纖維化組織會形成肝硬化的結節，逐漸變成肝硬化，甚至是肝衰竭[1]。現代分子生物學研究發現，肝纖維化是由多因子、多細胞共同參與的一個復雜的動態病變，活化的肝星狀細胞是參與肝纖維化形成與發展的主要細胞，其中涉及多個靶點和多條通路[2-3]。早發現、早治療是肝纖維化治療的重要手段，干預肝纖維化進程是該病治療過程中極其重要的關鍵環節，因此尋求有效阻止肝纖維化進程的藥物是目前研究的熱點之一[2]。

中藥在肝病的治療過程中有其獨特的優勢，具有多成分、多靶點、多通路的協同調控作用機制，在治療肝病的同時兼顧機體的整體調節[4-5]，符合中醫治病的整體觀念。茵梔黃顆粒源于《傷寒論》中的茵陳蒿湯,是由茵陳、梔子、黃芩、金銀花4味藥物的提取物制成的中藥制劑，具有清熱解毒、利濕退黃的功效，臨床上主要用于各種肝炎的治療[6]。方中茵陳味苦性微寒，善能清熱祛濕、利膽退黃，為君藥；梔子清三焦火邪，除肝膽濕熱而退黃；黃芩清熱燥濕、瀉火解毒，與梔子共為臣藥；金銀花甘寒，清熱解毒，用為佐藥，全方清熱解毒、利濕退黃。現代藥理學研究證實，茵梔黃顆粒具有利膽退黃，保肝利膽，治療肝炎、肝纖維化以及肝內膽汁淤積的作用[7-8]。

隨著醫學的高速發展和大數據時代的到來，網絡藥理學應運而生，并能很好地與中醫藥整體觀、辨證論治不謀而合[5]。網絡藥理學通過構建成分-靶點-疾病等相互作用網絡，從整體角度來研究藥物對整個機體的影響，揭示中藥復方多成分、多靶點、多通路協同增效的作用機制，為中藥復方物質基礎和作用機制研究提供新的方法[9]。分子對接能夠預測化合物與靶蛋白之間的親和力，已成為計算機輔助藥物研究領域的一項重要技術。由于目前缺乏茵梔黃顆粒對肝纖維化治療的物質基礎、作用靶點、通路調控機制的深入研究，本文借助網絡藥理學和分子對接方法篩選茵梔黃顆粒有效成分、作用靶點及其作用機制，為其臨床應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 茵梔黃顆粒活性成分及靶點的收集

運用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)和中國知網、萬方、維普三個數據庫的文獻檢索，分別收集茵梔黃顆粒中茵陳、梔子、黃芪、金銀花4味中藥的的化學成分，以口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%和類藥性(drug-likeness, DL)≥0.18為篩選條件[10-11]篩選出茵陳、梔子、黃芪、金銀花的活性成分。潛在活性成分的SMILE結構式利用PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)進行搜集，并導入SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)進行靶點預測。

1.2 茵梔黃顆粒與肝纖維化相關靶點的篩選

從GeneCards(https://www.genecards.org/)數據庫中下載與肝纖維化相關的靶點，將上述SwissTargetPrediction預測得到的靶點與從GeneCards數據庫下載的肝纖維化的靶點在Venn2.1.0中取交集，獲取共有靶點作為茵梔黃顆粒治療肝纖維化相關的靶點，用于下一步的分析。

1.3 化合物-靶點網絡構建與分析

將茵梔黃顆粒的候選活性成分與靶點的一一對應關系導入到Cytoscape3.9.0軟件，構建化合物-靶點網絡圖，節點分別代表化合物和靶點，邊代表化合物與靶點的相互作用關系，采用Network Analyzer插件分析網絡拓撲性質,計算節點的度值(degree)。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建與分析

利用STRING數據庫構建蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction, PPI)網絡圖，將茵梔黃顆粒作用于肝纖維化相關的靶點導入STRING數據庫，物種選擇“Homo sapiens”，置信度設定為≥0.5，獲得蛋白質之間的的相互作用關系，并以TSV格式保存下載，導入Cytoscape3.9.0軟件，分析網絡拓撲性質，根據度值篩選核心靶點。

1.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析

將茵梔黃顆粒與肝纖維化的相關靶點輸入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數據庫，分別進行基因本體(gene ontology, GO)功能富集分析和基于京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析，GO富集分析以P<0.05為篩選條件，選取下載結果中P值小于0.05的前15個生物學條目繪制條形圖。KEGG富集分析同樣以P<0.05為顯著富集篩選條件，選取P<0.05的前15條信號通路繪制氣泡圖進行可視化分析。

1.6 分子對接

茵梔黃顆粒中主要活性化合物的3D結構從PubChem數據庫中下載，核心靶蛋白的3D結構從Protein Data Bank(https://www.rcsb.org/)數據庫下載。用Pymol軟件對核心靶蛋白進行去除溶劑分子等的初步處理，再用AutoDock Tools進一步加氫處理、加電荷處理，將核心靶蛋白和活性化合物保存為“pdbqt”格式的文件，并設置合適的格子位置和大小，最后，由Autodock Vine完成成分和靶點的對接。

2 結果及分析

2.1 茵梔黃顆粒活性成分的收集及靶點預測

通過TCMSP數據庫，檢索茵梔黃顆粒中的4味藥，共得到530個成分，其中茵陳53個，梔子98個，黃芩143個，金銀花236個。以同時滿足OB≥30%和DL≥0.18為篩選條件，分別得到茵陳有效成分13個，梔子12個，黃芩14個，金銀花11個，刪除重復的共有成分，共計43個活性成分。一味藥可以含有多種活性成分，同一個活性成分也可以來自多味藥，表明不同中藥之間具有共同活性成分，與中藥具有多成分、多靶點的協同作用機制是一致的，配伍使用具有協同增效的作用，為方便后續研究，這些成分被編號為MOL01～MOL43。通過SwissTargetPrediction數據庫預測出茵梔黃顆粒的43個活性成分潛在作用靶點，刪除靶點重復項后，得到778個靶點。

2.2 肝纖維化的相關靶點的收集及茵梔黃顆粒治療作用靶點的篩選

通過篩選GeneCards數據庫的檢索結果，選取相關性得分≥10的前500個肝纖維化的靶點，與茵梔黃顆粒有效成分的778個靶點取交集，二者映射后確定了111個共同作用靶點，作為茵梔黃顆粒作用于肝纖維化的潛在靶點，見圖1。

圖1 茵梔黃顆粒和肝纖維化交集靶點的維恩圖Fig.1 Venn diagram of the intersection targets of Yinzhihuang Granules and liver fibrosis

2.3 茵梔黃顆粒化合物-靶點網絡構建與分析

茵梔黃顆粒的化合物-靶點網絡圖見圖2，該網絡圖有154個節點，其中包括活性化合物43個(三角形)，潛在靶點111個(圓形)，717條邊，邊代表化合物與靶點之間的靶向關系。43個活性成分作用于111個靶點，在一定程度上體現了中醫藥通過不同的活性成分作用于同一靶點，以及同一活性成分作用于多個靶點的作用機制。采用插件分析網絡拓撲性質，在網絡圖中，節點的大小代表該節點度值的大小，度值越大，表明該節點在該網絡中的樞紐作用越強，度值排名前15的主要成分見表1，43個活性成分的詳細信息見OSID科學數據與內容附表1。基于此分析發現活性成分中槲皮素節點的度值最大，其次為β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、梔子苷、綠原酸、黃芩苷等。

表1 茵梔黃顆粒的主要活性成分Table 1 Fifteen main active ingredients of Yinzhihuang Granules

圖2 活性成分-靶點網絡圖Fig.2 Network diagram of the active ingredient targets

2.4 PPI網絡圖分析

將111個茵梔黃顆粒治療肝纖維化相關的靶點導入STRING數據庫，獲得PPI關系，隨后導入Cytoscape3.9.0軟件進行分析，見圖3。采用Network Analyzer插件分析網絡拓撲性質，計算度值，設置顏色的深淺和節點的大小反映度值的大小，根據度值的大小選出6個核心節點，分別是STAT3、AKT1、IL-6、TNF、EGFR、SRC，基于此推測這6個靶點為茵梔黃顆粒治療肝纖維化的關鍵靶點。

圖3 PPI網絡Fig.3 PPI network

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路分析

利用DAVID數據庫對篩選出的與肝纖維化相關的111個靶點進行GO富集分析，分別選取P<0.05的生物過程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)、細胞組成(cellular component, CC)的前15條目繪制條形圖，如圖4所示。縱坐標代表GO的各個條目，橫坐標代表富集到與該條目的靶點數目。BP主要涉及凋亡過程的負調控、細胞增殖的正調控、蛋白質磷酸化的正調控、內皮細胞增殖的正調控等；MF主要包括酶結合、受體結合、蛋白酶結合等；CC主要包含線粒體、蛋白質復合物、細胞內膜結合的細胞器等。

圖4 GO功能富集分析Fig.4 GO functional enrichment analysis

利用DAVID數據庫對靶點進行KEGG通路富集分析，一共富集得到110條信號通路，本研究選取下載結果中P<0.05前20條通路繪制氣泡圖進行可視化分析，如圖5所示。富集結果顯示主要涉及PI3K-Akt信號通路、乙型肝炎、丙型肝炎、VEGF信號通路等信號通路，通路之間通過發揮協同作用起到治療肝纖維化的作用。

注：圖中氣泡大小代表通路富集的靶點個數；圖中的顏色的變化代表P值的大小。圖5 KEGG 通路富集分析Fig.5 Enrichment analysis of the KEGG pathway

2.6 分子對接

根據活性成分-靶點網絡圖里活性成分度值的排名以及文獻調研[12-15]，本研究將活性成分槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、梔子苷、綠原酸、黃芩苷與PPI網絡里的排名前6的核心靶點STAT3、AKT1、IL6、TNF、EGFR、SRC進行分子對接，部分結果見表2，全表詳見OSID科學數據與內容附表2。其結合能均小于-20 kJ/mol，結合能越小表示結合活性越高，化合物越容易與該靶點結合。黃芩苷與EGFR結合能最低，其次是黃芩苷與STAT3，表明黃芩苷與EGFR、STAT3結合活性最強，分子對接情況如圖6所示。

表2 部分化合物與靶點分子對接結果Table 2 Molecular docking results of the compounds and targets

圖6 化合物與靶點分子對接圖Fig.6 Molecular docking diagram of the compounds and targets

3 討論

茵梔黃顆粒源自中醫經典名方“茵陳蒿湯”,現代藥理研究表明茵梔黃顆粒具有清熱解毒、利膽退黃、促進肝細胞再生、光譜抗菌等功效[16]。臨床研究發現，茵梔黃顆粒可明顯降低酒精肝患者的炎癥反應[4]，具有抑制肝細胞炎性病變、積極調控肝內微循環、增強膽管收縮力，促進膽汁分泌與排泄[16]的功效。茵梔黃顆粒在肝病的治療中已得到廣泛應用，為了深入研究茵梔黃顆粒治療肝纖維化的作用機制，本研究采用網絡藥理學的方法，借助多個數據庫收集得到茵梔黃顆粒中530個成分和其對應的778個靶點，根據OB和DL參數篩選出43個活性成分，其中111個靶點與肝纖維化相關。

通過分析化合物-靶點網絡圖，發現槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、梔子苷、綠原酸、黃芩苷有較高的度值，其對應的靶蛋白數目相對于其他成分較多，可能是茵梔黃顆粒治療肝纖維化的主要有效成分。其中槲皮素的度值最高，該復方中的的槲皮素來自茵陳、梔子和金銀花3味藥材，在肝臟疾病領域，槲皮素在非酒精性脂肪性肝病和肥胖癥中表現出調節脂肪、調節腸肝軸、穩定肝星狀細胞以減少纖維化和影響丙型肝炎病毒生命周期的能力[12,17]，研究發現槲皮素可通過上調IL-10和HO-1的表達從而抑制NLRP3炎癥小體激活和炎癥因子分泌，進而發揮對急性酒精性損傷肝的保護作用[12-13]。β-谷甾醇是茵梔黃顆粒中茵陳、梔子、黃芩、金銀花4味藥材均含有的成分，研究表明，β-谷甾醇能抑制血清中酒精引起的生化指標的變化，減輕酒精引起的氧化應激，例如恢復紅細胞膜流動性、減少谷胱甘肽消耗、恢復抗氧化酶活性和減少丙二醛的過度產生，β-谷甾醇還可以通過PI3K/Akt通路下調凋亡相關基因的表達[14]。此外，β-谷甾醇成功地減輕了二甲基亞硝胺誘導的小鼠肝損傷，并防止了膠原的積聚，具有抗肝臟纖維化的功效[18]。木犀草素是金銀花的活性成分，能夠降低小鼠肝指數和血清中AST、ALT的水平，改善肝細胞脂肪變性和炎性細胞浸潤、壞死，對酒精所致小鼠急性肝損傷具有保護作用[15]。山奈酚對四氯化碳引起的小鼠急性肝損傷具有保護作用，顯著降低肝細胞壞死和炎癥細胞浸潤的范圍和程度[19-20]。梔子苷為梔子的主要活性成分，也是《中國藥典》要求的檢測成分，能夠下調炎性因子TNF-α、IL-1和IL-6的表達，抑制TLR4表達NF-κB的活化，起到抗炎的作用，此外還具有改善肝纖維化的功能[21-22]。綠原酸是一種多酚類化合物，具有抗氧化和抗炎特性，已有研究表明綠原酸可以有效地減輕大鼠肝纖維化，通過抑制炎性因子的表達在急性酒精性肝損傷中起到保護作用[23-24]。黃芩苷能夠改善肝功能和炎癥指標，對肝臟起到保護作用，已有研究表明黃芩苷有效地減輕了MCD飲食誘導的肝脂肪變性、炎癥、纖維化和細胞凋亡，黃芩苷的這些調節作用是通過調節脂質代謝、抑制促炎細胞因子如TNF-α等進而預防肝纖維化[25]。此外還有研究證明，黃芩苷通過抑制氧化應激，從而減少炎癥和細胞凋亡，對ATO誘導的急性肝損傷具有保護作用，通過調控STAT3等關鍵蛋白進而調控JAK2/STAT3信號通路參與對肝臟的保護作用[26]。

本研究通過對PPI網絡拓撲學分析發現，排名前6位的核心靶點分別為STAT3、AKT1、IL6、TNF、EGFR、SRC。信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)通過參與肝星狀細胞的增殖和活化進而參與到肝纖維化的過程中，在肝細胞中，適度表達的STAT3可促進肝細胞再生，有助于肝臟的修復，但是STAT3的過表達導致肝星狀細胞活化、過度增殖，誘發肝纖維化，甚至是肝臟癌變[27]。AKT1參與調節機體生長代謝和血管生成等多個過程，研究顯示，哺乳動物雷帕霉素復合物靶蛋白2(mTORC2)在c-Myc驅動的小鼠肝細胞癌中被激活，導致AKT1磷酸化激活，c-Myc的激活與磷酸化AKT1的表達密切相關。AKT1高表達與肝癌患者生存期差有關，AKT1的缺失可完全阻止小鼠c-Myc誘導的肝細胞癌形成[28]，調節AKT1誘導血管新生、保護血管，從而改善肝纖維化[29]。白細胞介素6(IL-6)是一種在體內具有多種生物學功能的細胞因子，在正常生理條件下，是肝組織穩態、肝臟再生、抗病毒和代謝功能微調所必需的。IL-6是適應性免疫的重要調節劑，誘導T細胞分化并調節自身免疫。IL-6可以增強抗病毒適應性免疫反應并減輕慢性感染期間T細胞的耗竭，是調節肝臟再生和支持效應免疫功能的關鍵因素，表明IL-6的這些功能可用于肝臟病治療[30-31]。TNF-α可以誘導多種致纖維化、致炎因子產生，對肝纖維化的啟動及調控起重要作用，TNF-α是激活肝星狀細胞持續活化的核心細胞因子，肝星狀細胞的持續性活化是肝纖維化發生的病理基礎，由此推測抑制TNF-α的表達有助于減緩細胞凋亡的發生和肝纖維的啟動[32]。Scheving等[33]研究發現，表皮生長因子受體(EGFR)及其配體與肝纖維化有關，降低EGFR的表達，可以抑制肝纖維化過程中血管生成和肝星狀細胞活化，進而逆轉部分肝組織的纖維化[34-35]。已有研究表明，SRC在硫代乙酰胺誘導的小鼠肝纖維化模型和肝硬化患者中表達上調，磷酸化的SRC在肝星狀細胞活化過程中上調，抑制SRC可以降低原代肝星狀細胞中α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達，并抑制轉化生長因子β(TGF-β)誘導的肝細胞中結締組織生長因子(CTGF)的表達，這些結果表明SRC在肝纖維化中起重要作用，抑制SRC的過表達可以防止肝纖維化[36]。

從KEGG通路富集中可知茵梔黃顆粒治療肝纖維化可能通過PI3K-Akt信號通路、乙型肝炎、丙型肝炎等關鍵通路發揮作用。PI3K-Akt信號通路的激活可以調控下游蛋白參與細胞增殖凋亡等一系列的生理活動，通過抑制PI3K-Akt通路信號的傳導來降低機體的氧化應激反應、降低炎性因子的表達水平，對活化的肝星狀細胞有抑制作用，可以阻止肝纖維化的進一步發展[37]。并基于分子對接初步模擬活性成分與靶標之間可能的分子作用機制，結合能的大小直接反映預測結果的可靠性，其結合能均小于-20 kJ/mol，結合能越小表示結合活性越高，表明化合物越容易與該靶點結合。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學和分子對接技術，初步闡明了茵梔黃顆粒多成分、多靶點、多通路協同增效治療肝纖維化的作用機制。茵梔黃顆粒可能是通過槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、梔子苷、綠原酸、黃芩苷等活性成分，作用于STAT3、AKT1、IL6、TNF、EGFR、SRC等靶點，參與多通路的調控，通過抗炎、抑制氧化應激反應和肝星狀細胞的活化等發揮治療肝纖維化的作用。該研究為進一步驗證茵梔黃顆粒治療肝纖維化的相關靶點及通路提供了依據，為茵梔黃顆粒新功能的發現以及治療肝纖維化新藥的開發提供了一定的參考依據，同時為深入開發茵梔黃顆粒提供了方法學支撐，也為后續的基礎機制研究奠定了基礎。但本研究僅從網絡藥理學和分子對接層面來探究茵梔黃顆粒抗肝纖維化作用的有效活性成分及作用靶點，存在一定的局限，因此在后續的研究中將進行分子生物學驗證，并結合體內外實驗進行進一步的驗證。