間歇浸沒式生物反應器在植物組織培養中的應用研究進展

許 鳳 ，張麗芳 ，蘇 艷 ，蔣亞蓮 ，王麗花 ，瞿素萍 ，張藝萍 ，2

（1.云南省農業科學院 花卉研究所/國家觀賞園藝工程技術研究中心/云南省花卉育種重點實驗室/昆明市花卉遺傳改良重點實驗室，云南 昆明650205；2.云南云科花卉有限公司，云南 昆明 650205）

植物組織培養技術從20 世紀60年代開始迅速發展并逐步成熟，大量應用于苗木快繁生產。傳統的植物組織培養采用固體培養基培養體系，主要包括外植體誘導、繼代、生根培養基的制備，外植體的采集、消毒、接種，外植體成功誘導出不定芽或愈傷組織以后的分化繼代培養，繼代增殖形成的無根芽苗生根培養，煉苗和移栽等技術環節，每個步驟都需要大量的勞動力，成本高、效率低。相對于固體培養，液體培養是另一種組織培養改進的方式，雖然該培養方式便于成本控制，但長時間的液體培養會引起組培苗玻璃化、畸形等問題。

植物間歇浸沒式生物反應器的基本原理是在無菌條件下，將無性繁殖材料在培養液中進行周期性的浸泡培養，其改進了液體培養的方式。在這種培養方式下，植物組織與液體培養基緊密接觸，刺激和促進了植物組織對營養元素和激素的吸收；間歇及連續振動給液體培養基提供了足夠氧氣，提高了組培苗的繁殖系數。植物間歇浸沒式生物反應器主要應用于快繁后期繁殖苗和生根苗的培育，其人工耗費是固體培養系統的1/2，成本可降低1/5，促進了自動化、機械化和商業化的植物快繁技術發展。

迄今，國外應用間歇浸沒式生物反應器進行組織培養成功的植物有香楓[1]、蘋果[2]、菠蘿[3]、挪威云杉[4]、白紋櫟[5]、甘蔗[6]、甜葉菊[7]、香石竹[8]、白楊[9]等，而國內的研究開始較晚，主要集中于次生代謝物的生產。與傳統植物組織培養相比，間歇浸沒式生物反應器優勢明顯，其自動化程度高、生產成本低、組培苗質量好、繁殖系數高、移栽成活率高及適應性強。為更好地將該技術裝備應用到植物組織培養中，筆者概述了間歇浸沒式生物反應器發展的階段、參數設置及優缺點等方面的進展。

1 間歇浸沒式培養系統的發展

間歇浸沒式培養系統的發展大概經歷了5 個階段，其中第3、4、5 階段發展的培養系統目前都還有應用，如氣泵驅動RITA（Recipient for Automated Temporary Immersion）間歇浸沒式培養系統也還在應用中，只是在不斷地改進中。

1.1 第1 階段

1985年，TISSERAT 等[10]設計了APCS（Automated Plant Culture System）自動化植物培養系統。整個系統由4 個部分構成：植物培養箱、玻璃營養液蓄池、葉輪泵及硅膠運輸管道。該系統由微型計算機控制，在葉輪驅動下實現了培養液的定期補充和排干，獲得了與傳統組織培養相同的效果，但避免了繁瑣繼代工作，降低了勞動成本。

1.2 第2 階段

1987年，AITKEN-CRISTIE 等[11]不斷改進APCS 培養系統，設計出一套半自動培養系統，將葉輪泵改為蠕動泵，將玻璃的營養液蓄池改為聚碳酸酯的營養液蓄池。每次液體更新40～60 mL，每周6～7 h；在供應營養液時通氣保證了培養物的氧氣需求，比無通氣培養效果更好。基于此，SIMONTON 等[12]于1991年設計出一套用于間歇供應液體的計算機控制泵，有4 臺培養容器，用帶孔聚丙烯代替瓊脂培養基，使營養循環實現預定的設計。第1、2 發展階段的培養系統培養周期較長，通氣和補液控制不好會導致污染。

1.3 第3 階段

1993年，ALVARD 等[13]設計了氣泵驅動RITA（Recipient for Automated Temporary Immersion）間歇浸沒式培養系統。該系統由2 個容器構成，下面是營養液存儲容器，上面是培育容器，中間連接有管道。當氣體進入營養液存儲容器時，都要通過0.22 μm 孔徑的濾膜以防止污染。應用這一系統對香蕉進行培養，與傳統的固體培養基、液體培養基培養比較，該培養系統的繁殖系數可提高1 倍，干質量可提高1～4 倍[13]。該系統容器體積小，結構復雜，價格昂貴，限制了其在發展中國家的推廣。

1.4 第4 階段

1999年，ESCLONA等[14]設計，后來由TEISSON改進命名的間歇浸沒式生物反應器系統（Temporary Immersion Bioreactors System，TIBS）出現，其主要包括空氣壓縮機、營養液存儲瓶、組培苗培養瓶、硅管、時控開關、濾膜孔徑0.22 μm 的針頭過濾器、電磁閥、培養架等部分。該系統的基本原理是以空氣壓縮機所形成的空氣壓力作動力，經過濾器除菌將液體培養基由儲存瓶壓入組培苗培養瓶，從而對植物組培苗進行間歇浸沒式培養。該系統培養菠蘿苗，以2 min/3 h 的浸沒頻率提供營養，在含多效唑激素的培養基中生長42 d 后，繁殖系數明顯提高，干、濕質量均顯著增加[14]。該系統目前比較常用，但培養周期長且易污染，仍需進一步改進。

1.5 第5 階段

2010年至今，研究者不斷優化之前的設計。SOLóRZANO 等[15]設計了一套低成本的氣動臨時浸沒式生物反應器系統，該系統有24 個2 L 的水箱。該自動化系統通過設計的定時器電路執行，其設計參數設置為：一是繁殖培養周期，該參數取決于所培養植物的繁殖周期，由操作員決定何時關閉系統；二是浸沒頻率，分別設定了1、2、3、4、5、6、7、8 h 的間隔浸泡時間（對應間隔通氣時間）和30、40、50、60、70、80 s 浸泡時間（對應壓縮空氣輸送時間）；鳳梨在這種浸沒生物反應器系統中培養30 d后繁殖系數為6.5[15]。

FLOREZ 等[16]設計了一種新的TIB（Temporary Immersion Bioreactors），一種靜壓驅動的TIB（Hydrostatic-driven TIB），該設計的原理是：培養基流入反應器是通過相對于培養容器升高培養基貯槽來實現的。其特點是定期升降培養基貯槽的高度可以保持植物組織臨時浸入，而不需要大量的氣體來壓入培養基。利用含氧量較高（40%）的氣體混合物可使植物發狀根培養物的生長速度加倍，并且補充二氧化碳可提高無籽西瓜分生組織培養物的光合能力。該系統的總體設計力求實現功能多樣性、可擴展性和最低成本等。面對日益增長的糧食需求、資源減少和環境退化等問題，生物反應器技術在提高植物生產力方面發揮著越來越大的作用。

2 間歇浸沒式生物反應器相關參數設置的研究進展

與傳統的組織培養類似，由于培養基的成分、激素組成和水平、蔗糖濃度、pH 值等各種培養條件不同，利用間歇浸沒式生物反應器進行植物組織培養的效果存在差異。此外，間歇頻率、浸沒時間、培養器容積、接種密度等參數對應用生物反應器進行植物組織培養的效果也有很大影響。

2.1 浸沒頻率和培養時間

不同植物種類對浸沒頻率和浸沒時間的要求是不一樣的。如果浸沒頻率大，組培苗就容易發生玻璃化；但如果浸沒頻率小，就會影響植株的營養吸收，對其生長有影響。同樣，間歇浸沒時間太短也會影響植株的正常生長；浸沒時間太長，組培苗會因氧氣缺乏而產生玻璃化、畸型等現象。因此，在應用間歇浸沒式生物反應器繼代1 個物種之前，必須先測試其適宜的間歇頻率。

ZHU 等[17]在培養蘋果生根苗時發現，每天浸沒16 次比浸沒8 次的效果更好。ALVARD 等[13]在利用間歇浸沒式生物反應器對香蕉組培苗培養后發現，浸沒頻率為每周2 次比每周1 次的效果更好。浸沒時間是間歇式浸沒培養的關鍵技術環節之一，對培養效率起決定性作用。ALBARRáN 等[18]在研究咖啡間歇浸沒培養參數發現，15 min/4 h 的浸沒頻率會產生90%的玻璃化苗；而1 min/4 h 的浸沒頻率可以形成大量魚雷胚，無玻璃化苗，75%的苗可以再生為完整植株。廉美蘭等[19]在利用間歇浸沒系統研究辰星草快繁時發現，其生長分化最理想的間歇頻率是每隔2 h 供給1 h 的培養基。JOVA 等[20]用間歇浸沒式生物反應器在多個山藥品種組培快繁的生長過程中發現，山藥在間歇頻率為10 min/6 h 時，其繁殖率和生長狀況是最理想的。DAMIANO 等[21]在間歇浸沒式生物反應器中培養野生梨和梨時發現，野生梨最適宜的浸沒時間為30 min/d，梨最適宜的浸沒時間為60 min/d。但也有一些植物種類對浸沒頻率的變化并不敏感。KONGBANGKERD 等[22]對海蔥（Charybdis numidica）進行研究發現，在5 min/12 h 和5 min/24 h 這2 種頻率下，其芽的再生率并無明顯變化。除浸沒頻率、浸沒時間以外，培養時間對培養效果也有影響。研究發現，車前草繼代培育6 代之后，繁殖系數下降十分明顯[12]；菠蘿組培苗在繼代培育7 周內的繁殖系數是最高的，但組培苗的活力明顯下降[23]。

浸泡次數對幼苗生長發育也有影響。ZHANG等[5]分析了浸泡次數對白紋櫟幼苗發育的影響，結果發現，浸泡頻率為3 min/2 h 時，可以顯著促進假球莖的發育。GAO 等[24]采用間歇浸沒式生物反應器（TIBS）對慈姑的繁殖和生長進行研究，結果表明，較高的浸沒頻率（每6 h 浸沒1 次）和較短的浸泡時間（3、10 min），其繁殖系數最高為23，顯著高于傳統的半固體培養（3.6）和液體培養（4.5）；而較低的浸泡頻率和較長的浸泡時間（30 min/12 h 和60 min/24 h）其莖尖的玻璃化率和污染率分別為16.6% 和19.0%、42.0% 和37.0%；與傳統的半固體和液體培養相比，TIBS（10 min/6 h）的污染率（8.3%）明顯降低；在含BA 4 mg/L+NAA 0.5 mg/L的培養基中，每6 h 浸泡10 min，具有較高的芽繁殖系數，達21.6，生根率為100%，成活率為94%。FRóMETA 等[25]對在非洲菊上應用間歇浸沒式生物反應器的浸泡頻率（1 次/6、8、12 h）、額外通風和培養時間（14、21、28、35 d）等因素進行了調查，結果發現，每8 h 浸沒加通風可增加不定芽數量且形態好，每個外植體平均繁殖系數為9；而每6 h 浸沒處理的嫩枝鮮質量和干質量較高，但同時水分含量較高；浸沒頻率為每8 h 浸沒1 次和每12 h 浸沒1 次時，枝條的水分含量無顯著差異；額外通風（12 min/d）使枝條的水分含量降低到5.24%，而無通風處理的為31.37%；每8 h 通風一次的枝條鮮、干質量降低，相對含水量下降89.8%；每個外植體分化的芽數量在14 d 時為3.5 個，21 d 時為5.5 個，28 d時為6.7 個，35 d 時為6.1 個。ZHANG 等[26]以半夏為材料，在間歇浸沒式生物反應器中對半夏幼苗進行了快繁研究，調查9 種不同的浸液循環對幼苗增殖、生長和多糖含量的影響，確定最佳浸液循環為wasIC-6（每12 h 浸5 min）。GAO 等[27]以荸薺球莖和匍匐根莖為材料，采用間歇浸沒式生物反應器（TIBS）對其莖尖進行繁殖，發現培養優化條件下（15 min/8 h）的繁殖系數最高，并能降低玻璃化率。

2.2 培養器體積空間

培養容器空間的大小對間歇浸沒式生物反應器系統的繁殖效率影響是很大的。在現實的生產和科學試驗中，為了減少繼代次數、提高效率，間歇浸沒式生物反應器采用的培養器體積一般為1～20 L，其體積大小遠大于固體培養基組織培養過程中所用的果醬培養瓶，可以幾個月或10 個月以上才轉接1 次。一般而言，在組織培養過程中，培養器的體積越大，培養器頂部空間就越大，這樣就能提供足夠的空間給組培苗生長，避免植物組培苗在培養器中過度擁擠，有利于植物組培苗的生長。采用更大的空間，有利于通氣處理，從而改善瓶內氣體組成，提高育苗質量和繁殖系數。ESCALONA等[14]在應用間歇浸沒式生物反應器培養菠蘿苗時發現，培養液的體積大小對繁殖速度、濕質量及干質量也有很大的影響，在生長過程中培養物長大后就會發生擁擠，培養物的質量下降。因此，在間歇浸沒式生物反應器培養系統中應適當地擴大培養的面積、加大通氣力度及減少對培養植株的空間限制，這樣才能提高繁殖系數和組培苗質量。

2.3 激素

靈活地應用激素可以大大提高組培苗繁殖的效率。限制大規模生產的關鍵因素在于單位產品成本高，合理使用激素提高繁殖系數和馴化成活率可大大降低成本。在菠蘿的大規模組織培養過程中，采用多效唑可提高腋芽的繁殖系數[14]。在金絲猴屬的植物組織培養過程中，可用噻苯隆（TDZ）來提高繁殖系數，再用其他激素來提高生根率和煉苗成活率[28]。在碟蘭球莖組織培養的不同階段，采用不同激素的培養基可獲得較高的繁殖系數，降低間歇浸沒式生物反應器的培養成本[29]。GAO 等[27]在含有4 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L NAA 的MS 培養基中應用間歇浸沒式生物反應器培養荸薺苗時發現，荸薺芽繁殖系數最高。

2.4 接種密度

接種密度是影響間歇浸沒式生物反應器培養效果的關鍵因素之一，不同的植物種類對接種密度的要求是不一樣的。接種密度太低不僅影響到組培苗的繁殖系數，還會影響到組培苗生長，且浪費培養基，增加生產成本；如果接種密度太大，則會由于苗量過多而導致植株過度擁擠，從而影響組培苗的正常生長，引起組培苗變異，對生產者造成巨大損失。ESCALONA 等[14]使用間歇浸沒式生物反應器對菠蘿進行組織培養時發現，當接種密度為5 株/L 時，菠蘿組培苗的繁殖和發育狀況是最好的。ZHANG 等[26]以半夏為材料，發現初始接種密度對繁殖系數和幼苗質量也有重要的影響。結果表明，繁殖系數、單株鮮質量及葉面積隨接種密度的增加而降低。在60 個/L 外植體的接種密度下，每個生物反應器的鮮質量最高，為762.18 g。較高的接種密度（每升80、100 個外植體）導致植株發育不良。ZHANG 等[5]分析了接種量對白紋櫟幼苗發育的影響，發現在TIBS 槽中接種300 株外植體，幼苗在莖粗、株高及葉寬方面的發育最好，其假鱗莖的發育也得到了明顯促進。

2.5 接種材料的質量

與采用固體培養基進行植物組織培養技術相比，在生物反應器體系中，接種材料質量好壞也會對植物組培苗的繁殖系數產生影響。楊柳等[30]在利用間歇浸沒式生物反應器培養甘蔗時，以第4 代通過半固體培養基誘導的組培苗為接種材料，甘蔗組培苗的增殖及生根情況較好。ROELS 等使用間歇浸沒式生物反應器系統快速繁殖香蕉時，發現當接種材料是第6、7 代香蕉繼代組培苗時，香蕉繁殖系數較高，生長情況較好[19]。IKRAM-UL-HAQ等[31]使用間歇浸沒式生物反應器系統進行香蕉組織培養得出的結論與ROELS 等的結論類似。

在應用間歇浸沒式生物反應器進行植株快繁時，要充分考慮應用的接種材料，一定要選用繼代次數少的繁殖苗作為接種材料；其次在培養基配方上也要進行充分的篩選，以選擇最適宜的繁殖和生根階段的培養基配方；再次應針對不同體積的培養容器篩選適宜的接種密度；最后對浸沒頻率和培養時間也應進行充分研究。

3 間歇浸沒式生物反應器擴繁植物的優勢

應用間歇浸沒式生物反應器培養植株的優勢是很明顯的，主要體現在3 個方面。

3.1 繁殖的組培植株質量好且繁殖系數高

在間歇浸沒式生物反應器中，培養物間歇浸沒于液體培養基和間歇性處于通氣環境。氣液交替和干濕交替，避免和減少了液體培養產生畸形苗和玻璃化苗等不良生長狀態，改善培養植株的葉綠素含量、凈光合率及蒸騰速度等生理指標，組培植株生長得更好[32]。間歇浸沒培養能提供足夠的營養和氧氣，減少培養環境中不利氣體的積累。例如，ROELS 等[33]在研究芭蕉的浸沒培養時發現，間歇浸沒式生物反應器可以大大減少培養空間中二氧化碳（5.7%）和乙烯（0.06 μL/L）的濃度，從而保證芭蕉小植株能快速生長，且品質較好；而在半固體培養基上培養芭蕉，二氧化碳和乙烯濃度分別達到最大值12%和0.45 μL/L。在半固體培養基上最低氧濃度為15.1%，而間歇浸沒式生物反應器中氧濃度更高，為19.3%。間歇浸沒式生物反應器中芭蕉繁殖系數為6.4，而在半固體培養條件下為4.3，芽高（4.3 cm 與3.3 cm 相比）和葉數（2.6 與1.6 相比）也是如此。而且在半固體培養基上培養的畸形苗較多。利用間歇浸沒式生物反應器繼代培養芭蕉苗，可以明顯減少芭蕉苗的繼代接種次數，更新培養基相對容易，繼代材料能長時間生長于一致的繼代培養環境及培育狀態，明顯提高芭蕉繁殖苗的培養質量及繁殖系數，進一步提升了芭蕉產量[34-35]。

KIM 等[2]比較了傳統的固體、液體、間歇浸沒式生物反應器培養系統生產脫毒蘋果幼苗的效果，發現蘋果植株鮮質量以間歇浸沒式體系最高，枝條最長，約為固體培養的2 倍；蘋果根系最長，根數也高于固體培養；植株的總莖面積最大，為1.46 mm2；同時間歇浸沒式生物反應器培養能夠在短時間內產生大量的脫毒植株，且植物莖中次生木質部發育良好。MAMUN 等[4]研究發現，挪威云杉（Picea abiesL.）在生物反應器中的產量比在固體培養基中高3～5 倍。MARZIEH 等[8]比較了間歇浸沒式生物反應器（TIB）和固體培養康乃馨的效果，研究發現，應用3 mg/L 6-芐氨基嘌呤（BAP），在TIB 中的新芽數為14.3 個，但在相同處理下固體培養基上的新芽數為5.7 個；在TIB 中使用3 mg/L BAP，康乃馨的初始鮮質量在15 d 后從10 g 增加到450 g；在TIB 中的芽產量是固體培養基的10 倍以上；通過應用1 mg/L 吲哚丁酸（IBA），在TIB 中成功誘導康乃馨苗生根，與固體培養中的生根苗相比，TIB 中的根數最多（4.6 條）和根長度最高（6.87 cm）。EDWARD 等[9]利用間歇浸沒式生物反應器進行樹木類的快繁時發現，與固體培養基相比，在間歇浸沒式生物反應器中培養外植體可顯著提高桉樹和白楊的繁殖率和鮮質量，但對毛樺木則無顯著影響。

3.2 高效生產代謝物

甜葉菊因含有低熱量的糖苷甜味劑而有益于糖尿病的治療，其自然繁殖和營養繁殖效率低下。通過甜葉菊的離體繁殖技術生產天然甜味劑有望解決此問題，但其增殖率和再生率較低。KAREL等[7]比較了甜葉菊在半固體培養基、液體培養基及生物反應器中的生物量和甜菊糖苷的產量，發現在培養21 d 時，生物反應器中的再生苗形態質量最好，且其鮮質量和干質量比在液體或半固體培養基中高7 倍以上。生物反應器中產生的甜菊糖苷的總含量也較高。PRAMITA 等[36]研究生長調節劑和浸沒頻率對平臥菊三七在間歇浸沒式生物反應器中生物量和黃酮類化合物產量的影響，發現在浸沒頻率為15 min/12 h 的條件下，結合MS+IAA 2 mg/L+BA 8 mg/L 的培養基培養，可獲得最高的黃酮類化合物產量。

3.3 移栽馴化的再生植株品質好

用間歇浸沒式生物反應器培養的植株比傳統固體培養和液體培養的植株更容易馴化移植成活。ACANDA 等[37]將肖竹芋生根苗在有遮陰設施的溫室中移栽馴化生長一段時間后發現，與固體培養基培養相比，間歇浸沒式生物反應器培養的植株光合速率高，其葉面積、鮮質量及干質量都明顯增加。ARAGO 等[38]選擇了間歇浸沒式生物反應器培養和半固體培養基培養的芭蕉植株進行移栽馴化，并比較了2 種培養體系的離體葉片解剖結構、離體光合行為和生長情況，結果表明，與半固體培養基培養的植株相比，間歇浸沒式生物反應器培養的植株葉片葉綠體和薄壁組織較厚，氣孔密度較低，表皮蠟質較多，因此，推測可能是激活了自身的抗氧化防護系統，能夠抵御移植環境所帶來的威脅；半固體培養基培養的植株葉片葉綠素熒光參數Fv/Fm值始終低于間歇浸沒式生物反應器培養的植株；間歇浸沒式生物反應器培養的植株移栽后第7 天葉片Fv/Fm 值下降至0.65，之后迅速上升至0.76；而半固體培養基培養的植株葉片Fv/Fm 值在移栽后第7 天下降至0.27，在第35 天緩慢上升至0.68；在離體馴化過程中，間歇浸沒式生物反應器植株的光合速率明顯高于半固體培養基培養植株；間歇浸沒式生物反應器的植株葉面積、鮮質量及干質量均高于半固體培養基的植株。

對移植田中的RITA 培養的香蕉再生植株進行生長調查，發現與傳統的組織培養植株相比，在田中生長的初期，植株的莖粗、高度等參數有一定差異，但隨著種植時間的延長而逐漸消失[39]。通常，RITA 生物反應器生產的組培苗在移栽后不會發生表型變異，可能與利用RITA 培養植株時所用的植物生長調節劑濃度低和培養周期短等有關[40-41]。

HUGO 等[42]在半固體（SS）培養基、RITA 生物反應器和雙瓶式間歇浸沒型生物反應器（TIS）中培養油棕魚雷階段的體細胞胚，而后評價再生植株在溫室中的適應性，結果表明，當體細胞胚在生物反應器中培養大約90 d 后，統計再生植株的數量與質量，TIS 系統培養的生物量積累最大，再生的植株有36% 高于2.5 cm，在溫室移栽成活率約為82%，且適應性好，而在SS 和RITA 系統中再生的植株約有15%高于2.5 cm。GAO 等[27]比較了在間歇浸沒式生物反應器中培養的荸薺植株和在半固體培養基培養的植株移栽到溫室后的生長情況，發現間歇浸沒式生物反應器培養的荸薺植株具有較好的適應能力，能產生更多的匍匐根莖（5.0～5.8 根），而半固體培養基培養的植株產生的匍匐根莖要少一些（4.2～4.8 根），意味著間歇浸沒式生物反應器培養的植株產量將會增加。

應用間歇浸沒式生物反應器培養植株可實現植株的快速繁殖，繁殖效率大大提升，且植株品質明顯提高，如玻璃化苗和畸形苗減少，產量增加，抗性增強，適應環境的能力加強，更容易馴化成活。

4 間歇浸沒式生物反應器的缺點及其對策

應用間歇浸沒式生物反應器進行植物組織培養也存在一定的局限性，如不是所有的植物種類都可以應用該系統；由于培養的時間長，控制不好就會導致全部污染，但諸多研究也在嘗試解決污染的方法。

4.1 并不適用所有物種

不同栽培物種對間歇浸沒的生長要求各不相同，大多數在間歇式浸沒生物反應器的培育中可以生長得很好，但也有一些物種在間歇浸沒期間不能生長得很好，反而在持續浸沒中生長會更好。FEUSER 等[43]對馬鈴薯組培苗進行培養后發現，與持續半浸沒相比，幼芽在間歇浸沒式生物反應器中生長較好，但是芽的連續生長、繁殖發育速度較慢，因此，培養費用相對來說更高。

4.2 污染限制其推廣

在單瓶生物反應器進行組織培養過程中發現，采用更大的營養液容器和利用蠕動泵或其他動力機械提供營養，由于污染難以控制而導致失敗。現在一般采用雙瓶培養，進出營養液均經過嚴格的無菌化過濾，但培養過程仍未脫離無菌環境，大規模的應用還是會受到污染的限制，如桉樹的生物反應器（RITA）培養桉樹初代苗污染率就達到100%[44]。

常用的防污方法是消毒外植體后，將抗生素加入到培養基中，抗生素類藥劑主要有Plant preservative mixture（PPMTM）、Vitrofural（G-1）和納米銀（silver nanoparticles，AgNPs）等[45-47]。G-1和PPMTM在培養基中可以明顯地抑制污染，還會促進植物的生長。試驗表明，G-1 能夠顯著提高培育苗的質量，替代高溫滅菌，還節省勞力。PPMTM在多種植物微繁過程中也有應用。崔剛等[48]對葡萄進行了開放性試驗，發現抑生劑可以代替高溫處理和無菌操作，在不影響植物生長的情況下，將污染限制在10%左右。HVOSLEFEIDE 等[49]研究發現，pH 值的迅速變化可作為植物組織培養是否受污染的標示參數。一般來說，在組織培養初期，pH 值總會下降，因為細胞會首先使用任何銨離子，從而釋放H+離子到培養基中。隨后，培養基中的銨離子耗盡，細胞代謝將改變為使用硝酸鹽離子并釋放OH 離子來交換帶負電荷的硝酸鹽，所以，導致pH 值上升。但在生物反應器中，pH 值會提前開始上升，其原因可能是由于生物反應器中培養物的增長更快。與硝酸鹽相比，銨的吸收導致pH 值的降低更快；當細胞開始吸收硝酸鹽離子時，銨離子消耗得更快。因此，在間歇浸沒式生物反應器中，污染的物質能迅速消耗營養液中的銨離子，從而使pH 值明顯上升。MARIEM 等[50]研究發現，添加植物防腐劑混合物能有效控制鞘氨醇單胞菌的繁殖。

4.3 多應用于組培苗

大多數研究主要采用固體培養的組培苗進行間歇浸沒式生物反應器的培養，但對細胞和體胚的培養較少，反應器還需要進一步完善和精細化。2005年，ANNE 等[51]對體胚微繁生物器進行了設計試驗，對容器內的微環境進行了調整優化，促進了體胚細胞的繁育。

在應用間歇浸沒式生物反應器進行植物組織培養時，要選擇適宜該系統的植物種類，同時可以探索該系統在細胞培養、原生質體培養及遺傳轉化體系中的應用。

5 展望

間歇浸沒式生物反應器技術是植物組織培養研究的新熱點。該技術體系與傳統的固體和液體培養方式相比較，顯著提高了繁殖效率，節省了成本，通過該技術培養的生根植株在溫室馴化和移栽中成活率明顯增加，已在多種植物的繁育、突變體篩選等方面應用。目前，RITA 和TIBS 的間歇浸沒式生物反應器是應用較為普遍的類型，這2 種系統進一步優化，能更廣泛地應用于植物種苗的工廠化生產中。同時在應用該系統進行植物組織培養時，還可以考慮固體培養和生物反應器培養相結合，先利用固體培養基誘導外植體，再將繼代苗接種至間歇浸沒式生物反應器中進行快速繁殖和生根，這樣可以充分發揮間歇浸沒式生物反應器的優勢。