錯配修復(fù)基因MLH1、MLH2、MHL6、PMS2在胃癌組織中的表達(dá)及與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)性

申志華 王賀 花海洋 李常洲 段思杰

(承德市中心醫(yī)院 1病理科,河北 承德 067000；2消化血液內(nèi)科；3體檢科)

胃癌(GC)為臨床最常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤，為我國第三高發(fā)惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率及死亡率，嚴(yán)重威脅人們身心健康〔1,2〕。目前關(guān)于GC的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，普遍認(rèn)為發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在GC的發(fā)生及發(fā)展過程中占據(jù)重要地位，腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移、放化療過程中腫瘤出現(xiàn)適應(yīng)性及腫瘤干細(xì)胞的產(chǎn)生均與EMT關(guān)系密切〔3～5〕。DNA作為遺傳信息的載體，DNA結(jié)構(gòu)的高度保守性是維持機(jī)體健康的重要保障，在腫瘤發(fā)生過程中涉及多種癌基因和抑癌基因的突變和積累。錯配修復(fù)基因(MMR)是機(jī)體保證遺傳信息高度保守性的重要機(jī)制，MMR可通過修復(fù)DNA復(fù)制過程中因堿基錯配導(dǎo)致的基因突變或異常，從而保證DNA復(fù)制的穩(wěn)定及準(zhǔn)確性〔6〕。MMR蛋白表達(dá)的缺失，可引起多種致癌基因的激活及抑癌基因活性的喪失，最終誘發(fā)腫瘤的發(fā)生〔7〕。

目前MMR表達(dá)和突變檢測已被規(guī)范地應(yīng)用于結(jié)直腸癌患者篩查。GC組織中同樣存在MMR異常表達(dá)情況〔8〕，但關(guān)于MMR異常表達(dá)對GC發(fā)生影響的相關(guān)研究鮮有報道，本研究觀察GC組織標(biāo)本中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白的表達(dá)并對其與EMT的相關(guān)性進(jìn)行分析，以探討MMR異常表達(dá)與GC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年12月至2021年6月承德市中心醫(yī)院行GC根治性手術(shù)患者127例，所有入選病例臨床資料完整，術(shù)前均未接受過特殊藥物治療或放化療。127例GC患者中，男88例，女39例；年齡52～69歲，平均(61.2±21.3)歲；腫瘤直徑≥5 cm者57例，<5 cm者70例；低分化72例、中分化39例、高分化16例；黏膜層浸潤21例、肌層浸潤33例、漿膜層及以上73例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期48例，Ⅲ期79例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者86例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者41例。

1.2儀器及試劑 Minux FS800/FS800A冷凍切片機(jī)(瑞沃德)，ZY-TH-80恒溫培養(yǎng)箱(深圳市正源設(shè)備科技有限公司)，BX53型顯微成像系統(tǒng)(奧林巴斯)，PATH自動免疫組化儀(Biocare)；MLH1、 MSH2、MSH6、PMS2抗體(上海鈺博生物科技有限公司)。

1.3標(biāo)本免疫組化檢測

1.3.1MMR蛋白表達(dá)檢測 嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒操作說明書進(jìn)行操作，測定MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)表達(dá)情況，MMR蛋白陽性表達(dá)為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。

1.3.2上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換標(biāo)志物檢測 采用免疫組化法檢測E-鈣黏蛋白(cadherin)及波形蛋白(Vimentin)表達(dá)情況，E-cadherin陽性表達(dá)為細(xì)胞膜呈棕褐色或黃色，Vimentin陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色或黃色。Vimentin評分采用染色強(qiáng)度評分，評分0～1分為陰性，2～3分為陽性；E-Cadherin采用染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞數(shù)百分比評價，<10%為0分，10%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，75%～100%為4分。

1.4MMR蛋白表達(dá)對患者生存周期的影響 根據(jù)MMR蛋白表達(dá)情況，跟蹤隨訪MMR蛋白表達(dá)缺失患者與MMR蛋白表達(dá)非缺失組患者在12個月內(nèi)生存情況，采用Kaplan-Meier生存曲線，評價MMR蛋白表達(dá)對患者生存周期的影響。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行χ2檢驗、秩和檢驗、Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1MMR在GC及癌旁組織表達(dá)情況 127例GC組中MMR蛋白缺失率為31.5%(40/127)，MLH1、MSH2、MSH6、PMS2表達(dá)缺失率分別為20.47%(26/127)、14.17%(18/127)、8.66%(11/127)、16.54%(21/127)，MLH1/PMS2聯(lián)合缺失率為13.39%(17/127)，MLH2/MLH6聯(lián)合缺失率為5.51%(7/127)。

2.2MMR蛋白表達(dá)缺失率與GC臨床病理特征關(guān)系 MMR蛋白缺失與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度、TNM分期有關(guān)(P<0.05)。見表1。

2.3MMR表達(dá)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)性 MMR蛋白表達(dá)與上皮標(biāo)志物E-cadherin呈正相關(guān)(r=0.524，P<0.05)，MMR蛋白表達(dá)與間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin呈負(fù)相關(guān)(r=-0.471，P<0.05)。見表2。

表1 MMR蛋白表達(dá)缺失率與臨床病理情況的關(guān)系〔n(%)〕

2.4生存周期比較 MMR蛋白表達(dá)缺失組12個月生存率為62.5%(25/40)，生存中位期為8.79個月；MMR蛋白表達(dá)非缺失組12個月生存率為81.61%(71/87)，生存中位期為11.07個月，MMR蛋白表達(dá)非缺失組生存率及生存中位期均明顯高于MMR蛋白表達(dá)缺失組(P<0.05)。見圖1。

表2 MMR蛋白缺失率與E-cadherin、Vimentin表達(dá)的 相關(guān)性(n)

圖1 MMR蛋白表達(dá)缺失與MMR 蛋白表達(dá)非缺失患者 Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

GC為臨床高發(fā)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，目前胃癌居我國惡性腫瘤發(fā)病率第三位，GC前期診斷難度大，患者確診時多為進(jìn)展期，導(dǎo)致患者喪失最佳治療時機(jī)，GC患者死亡率居惡性腫瘤死亡率第二位，嚴(yán)重威脅患者生命安全〔9，10〕。腫瘤細(xì)胞的局部浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，在腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移過程中EMT占據(jù)極為重要的環(huán)節(jié)，是發(fā)生腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟〔11〕。EMT是指在上皮細(xì)胞在多種因素作用下向間質(zhì)細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化的過程，EMT的發(fā)生可導(dǎo)致上皮細(xì)胞喪失細(xì)胞極性，進(jìn)而引起細(xì)胞黏附性改變，細(xì)胞內(nèi)原有的肌動蛋白發(fā)生重新排列，使腫瘤細(xì)胞侵襲及遷移能力提升，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)〔12〕。

E-cadherin及Vimentin在EMT發(fā)生過程中具有重要作用，與EMT的發(fā)生關(guān)系密切。E-cadherin為跨膜糖蛋白，在調(diào)節(jié)正常細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞運動能力及黏附能力方面具有重要作用。E-cadherin可介導(dǎo)細(xì)胞間黏附功能的降低，使腫瘤細(xì)胞更易從原發(fā)病灶剝離，從而向周圍組織侵襲并發(fā)生遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移，E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附功能降低是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵步驟〔13，14〕。Vimentin為中間絲蛋白，在所有正常間質(zhì)細(xì)胞中均存在Vimentin表達(dá)，對維持細(xì)胞完整性、降低應(yīng)激損傷具有重要意義〔15〕。E-cadherin及Vimentin已經(jīng)成為發(fā)生EMT的重要標(biāo)志。

在發(fā)生DNA堿基錯配時正常機(jī)體內(nèi)存在一系列能夠識別并修復(fù)相應(yīng)錯誤的系統(tǒng)蛋白，這類系統(tǒng)蛋白被稱為錯配修復(fù)蛋白。MMR是細(xì)胞發(fā)生異常復(fù)制后的一種修復(fù)機(jī)制，在維持遺傳穩(wěn)定性和完整性方面發(fā)揮著重要作用〔16，17〕。機(jī)體MMR功能異?？稍斐杉?xì)胞DNA修復(fù)錯誤，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。錯配修復(fù)蛋白包含以MLH1、MLH3、PMS1、PMS2等為代表的MutL蛋白家族及以MSH2/MSH3、MSH6等為代表的MutS蛋白家族〔18〕。在上述MMR蛋白中，任何單一MMR基因表達(dá)的缺失均可導(dǎo)致MMR系統(tǒng)功能異常，使得基因變異及不良突變逐漸積累，機(jī)體自發(fā)突變率顯著增加，最終出現(xiàn)細(xì)胞增殖分化紊亂，從而增加罹患各種惡性腫瘤的風(fēng)險。目前MMR表達(dá)和突變檢測已被規(guī)范地應(yīng)用于結(jié)直腸癌患者篩查，研究顯示，20%～30%的GC患者存在MMR基因突變〔19〕。

本研究結(jié)果表明GC患者存在明顯的MMR蛋白缺失，其中MLH1、PMS2缺失率最高。MMR蛋白缺失在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化過程中具有重要作用，是預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化的重要指標(biāo)。同時本研究結(jié)果表明MMR蛋白的表達(dá)與EMT的發(fā)生關(guān)系密切，MMR蛋白表達(dá)的缺失可導(dǎo)致EMT的發(fā)生。本研究結(jié)果表明，MMR 蛋白表達(dá)情況與GC患者預(yù)后情況關(guān)系密切，MMR蛋白表達(dá)的缺失可導(dǎo)致GC患者死亡風(fēng)險的增加。