苗藥吉祥草含藥血清對氣道平滑肌細胞增殖及IL-1β/COX-2信號通路的作用機制

劉煒 李江 李同瑤 謝友良

(1貴州中醫藥大學第二附屬醫院，貴州 貴陽 550002；2貴州中醫藥大學)

炎癥因子、氧化應激和多條信號通路等因素均會引發慢性阻塞性肺關病(COPD)〔1～3〕氣道的黏液高分泌，其中白細胞介素(IL)-1β/環氧合酶(COX)-2信號通路是參加氣道黏液高分泌信號通路之一，但目前對此通路的研究還較少〔4〕。IL-1β和COX-2介導多種炎癥反應，讓腺體的分泌物大量增加，進而導致氣道黏液長時間處于高分泌狀態〔5〕。IL-1β是最早參與炎癥反應的炎癥因子，當其被多種因素激活時會增加IL-1β活性，導致過多的分泌炎癥因子，促進COX-2的表達，COX-2高表達會增加前列腺素類產物的合成，增加血管通透性和支氣管黏膜的水腫程度，大量腺體的分泌，過多的滲出物會阻塞氣道增加氣流阻塞，從而導致氣道黏液髙分泌〔6，7〕。吉祥草又叫觀音草，是多年生草本植物中的一種，在中國和日本廣泛生長，喜好山坡、山谷和密林下，一年四季均可采收，藥記載顯示苗藥吉祥草一般可新鮮使用或曬干使用〔8〕。藥物研究發現吉祥草對止咳、平喘、祛風、鎮痛等有一定的功效，在苗族當地常被用于治療咳嗽、支氣管炎等〔9〕。研究發現吉祥草對COPD氣道黏液高分泌可進行很好的治療，對患者痰液的分泌量能明顯減少〔10〕，但其對氣道平滑肌細胞(ASMCs)的影響尚不明確，本文對ASMCs給予苗藥吉祥草血清干預，觀察其對細胞的增殖及IL-1β/COX-2信號通路的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物 20只SD大鼠，清潔級，體質量220～250 g，合格證號：SCXK(貴)2015-0005，購自上海福萊生物科技有限公司；成年6～8周齡BALB/c小鼠(雌性)，購自遵義醫學院，合格證號：SCXK(黔)2018-0002。在安靜、適當室溫、避光的環境下自由攝食飲水。動物實驗經貴州中醫藥大學動物倫理委員會批準進行，實驗動物符合倫理委員會規定，倫理委員會編號：hyykll2017038。

1.2試劑與儀器 貴州中醫學院第二附屬醫院住院中藥房生產的苗藥吉祥草(臨床常用劑量30 g，用水煎服成300 ml)；美國Proteintech公司生產的IL-1β抗體和COX-2抗體；杭州碧云天生物技術研究所生產的BCA蛋白濃度測定試劑盒；Elabscience公司生產的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒；日本Olympus公司生產的IX71型相差顯微鏡；湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司生產的L400離心機；日本Nikon公司生產的DXM1200C型數碼相機。

1.3含藥血清的制備 將20只SD大鼠分為空白組和藥物組，每組10只。空白組每次給予1 ml生理鹽水灌胃，3次d；藥物組給予苗藥吉祥草灌胃，給藥劑量按照動物實驗與人體標準體質量計算公式計算，連續用藥7 d；給藥后均禁食8 h，第8天末次給藥1 h后腹腔注射10%水合氯醛麻醉各組大鼠，取腹主動脈血于離心管中，3 000 r/min離心15 min，0.22 μm微孔濾膜過濾，分裝于離心管中，56℃水浴30 min滅活補體，-20℃保存備用。

1.4ASMCs的分離、培養和鑒定 ASMCs的培養采用組織塊貼壁法。處死BALB/c小鼠，將小鼠的氣管和支氣管分離，用Hank平衡鹽溶液浸泡氣管和支氣管。將氣管的外膜分離干凈，刮除內皮，將其剪成1 mm3小塊后置于牛血清中，將青霉素和鏈霉素均加入到培養基中。當組織塊周圍的細胞生長融合至80%時，對ASMCs進行鑒定。傳代ASMCs后，取4～6代細胞用于實驗。

1.5細胞培養和分組 取第四代對數生長的ASMCs，胰酶消化細胞后接種于培養板中，將培養板置于常規培養箱(37℃、5%CO2)培養。待細胞融合度為70%～80%時，更換新的培養基再培養24 h。將細胞分為空白組：正常細胞在150 μl 10%大鼠空白血清培養基+13.5 ml無血清培養基中培養；高劑量組：正常細胞在含150 μl 10%大鼠苗藥吉祥草含藥血清培養基中培養；中劑量組：正常細胞在含75 μl 5%大鼠苗藥吉祥草含藥血清+75 μl 5%大鼠空白血清培養基中培養；低劑量組：正常細胞在含75 μl 2.5%大鼠苗藥吉祥草含藥血清+75 μl 7.5%大鼠空白血清培養基中培養。

1.6CCK-8檢測ASMCs增殖 將AMSCs細胞接種于96孔培養板中，滴加細胞懸液后加入每組相應的藥物。將孔板置入培養箱中培養，培養條件：5% CO2、37℃，將細胞分別孵育24 h、48 h和72 h。在96孔板的空版內加入CCK-8溶液，繼續培養細胞4 h。測定每孔在450 nm處的OD值。

1.7流式細胞儀檢測ASMCs凋亡 稀釋結合緩沖液為1×結合緩沖液，配制膜聯蛋白(Annexin)V/碘化丙啶(PI)染色工作液。將培養板中的培養基棄掉，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌培養板中細胞，棄掉PBS中胰酶消化細胞并孵育，顯微鏡下觀察細胞，當出現胞質回縮、細胞間不相互鏈接時，將胰酶棄掉，PBS吹打細胞制成懸液，置于流式管中，離心后棄上清液，用Annexin V/PI 染色工作液重懸細胞，吹打細胞后孵育，15 min后用流式細胞儀檢測細胞。

1.8ELISA檢測細胞培養上清液中IL-1β和COX-2含量 操作按照試劑盒說明書進行。

1.9Western印跡檢測細胞中IL-1β和COX-2蛋白表達 取3組細胞加入細胞蛋白裂解液0.5 ml均漿，在4℃環境下離心15 min，取上清液測量蛋白濃度；將蛋白煮沸5 min至變性，經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在5%脫脂奶粉PBST溶液室溫下封閉1 h，加入IL-1β、COX-2和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體；抗體在4℃的環境中孵育過夜，洗膜后加入二抗，在37℃的環境中孵育1 h，暗室發光。

1.10統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1ASMCs的鑒定 從BALB/c小鼠中分離并培養的AMSCs細胞具有典型的“峰谷”生長狀態。染色后發現AMSCs大部分呈陽性，可見所分離出的細胞即為ASMCs。見圖1。

2.2各組ASMCs增殖比較 和空白組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組細胞在48和72 h時ASMCs細胞增殖明顯降低，且呈逐漸遞減趨勢，低劑量組細胞增殖率及中劑量組細胞增殖率明顯低于高劑量組細胞增殖率(均P<0.05)。見表1。

2.3各組ASMCs凋亡比較 和空白組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組ASMCs凋亡率顯著增加，呈逐漸遞增趨勢，其中高劑量組ASMCs凋亡率顯著高于低劑量組及中劑量組(P<0.05)。見表1、圖2。

表1 各組細胞增殖、細胞凋亡率及細胞培養上清液中IL-1β和COX-2含量比較

圖2 流式細胞儀檢測ASMCs凋亡

2.4各組細胞上清液中IL-1β和COX-2含量及細胞中IL-1β和COX-2蛋白表達 和空白組相比，低、中、高劑量組細胞上清液中IL-1β和COX-2含量及ASMCs中IL-1β和COX-2蛋白表達明顯降低，且呈逐漸遞減趨勢，高劑量組細胞上清液中IL-1β和COX-2含量及ASMCs中IL-1β和COX-2蛋白表明顯低于低劑量組及中劑量組(P<0.05)。見表1、表2、圖3。

表2 各組細胞中IL-1β和COX-2蛋白表達比較

圖3 各組ASMCs中IL-1β和COX-2蛋白表達

3 討 論

中醫認為COPD屬于“咳嗽”等范圍，主要發病原因是肺、腎虛所致，主要病理特征為咳痰渾濁、有淤血等〔11〕；西醫認為COPD主要是由持續性的氣流受限所致，多種因素均可導致COPD的發生，其中IL-1β/COX-2信號通路在近些年研究較廣。促炎因子IL-1β是早期炎癥反應中重要的炎癥介質之一，可向氣道聚集炎癥細胞，且在炎癥細胞活化中占主導作用，在體內可和多種炎癥因子相互作用，加重COPD炎癥反應，進而加重肺組織和氣道結構的病理損傷〔12〕。IL-1β的分泌由炎癥刺激所產生，進而增加COX-2的活性，支氣管黏膜發生嚴重水腫，讓腺體的分泌大量增多，進而發生氣道堵塞〔13〕。當AMSCs表型轉化出現異常時，氣道的炎癥反應和高反應性也隨之增加，對氣道的重塑造成嚴重的影響。AMSCs的增殖、上皮細胞纖維化及血管生成等均是氣道重塑主要的組織學特征，其中細胞的增殖尤為重要。當機體受到慢性炎癥刺激時會增殖AMSCs的數量，細胞外基質中膠原組織沉積、肌膜增厚，進而導致氣道結構發生不可逆的改變〔14〕。目前我省對苗藥的研究較少，特別是苗藥的炮制研究和技術滯后對苗藥的發展造成了嚴重的影響〔15，16〕。

本研究發現，苗藥吉祥草血清對ASMCs的增殖有明顯的抑制作用。目前吉祥草在藥理作用方面的研究較少，現有研究報道主要集中在抗腫瘤作用上，其已被證實具有抗腫瘤、止咳、化痰、抗炎等作用。楊建瓊等〔17〕人建立體外抗腫瘤實驗模型，以人肺癌A549細胞為對象，研究吉祥草提取物，發現吉祥草萃取物能抑制A549細胞增殖并誘導細胞凋亡，顯示吉祥草具有抗腫瘤活性。

IL-1β是一種重要的炎癥介質，有多種細胞因子分泌，例如上皮細胞、巨噬細胞等〔18〕。在機體遭受到感染、損害、生理應激等時，多種細胞均會大量分泌IL-1β，其廣泛的生物活性會對多種炎癥和趨化因子進行誘導。研究發現在COPD氣道炎癥中IL-1β時重要的細胞因子，肺部慢性炎癥的發生會隨著IL-1β的增加而增加。COX-2是COX中一種誘導酶，在細胞受到各種因素刺激時迅速合成。多種物理因素及致病因素會導致氣道內炎癥反應增加，增加的炎癥細胞會促進COX-2的分泌。當IL-1β與某些受體結合后引起COX-2活性增強，進而影響氣道的通氣功能。本研究發現，苗藥吉祥草血清可降低ASMCs IL-1β和COX-2表達，進而降低肺部炎癥，改善COPD。駱彩虹等〔19〕通過對COPD患者研究發現，患者在治療后血清中IL-1β，COX-2和PGE2含量明顯降低，苗藥吉祥草可有效抑制血清中IL-1β，COX-2和PGE2水平。陳劍波等〔20〕研究發現，制備小鼠COPD模型后，吉祥草對COPD小鼠的癥狀有明顯的改善，其可能通過對炎癥因子表達進行抑制，進而對COPD肺臟病理損害進行修復。

綜上所述，苗藥吉祥草血清可抑制氣道平滑肌細胞增殖，促進其凋亡；對細胞中炎性因子IL-1β和COX-2表達也能進行有效的抑制。本實驗研究存在一定的不足，僅對細胞中兩種炎癥因子進行了研究，還不夠全面，今后應對多種不同的炎性因子進行研究，為苗藥吉祥草治療COPD提供理論支持。