不同能量密度低能量激光治療對大鼠運動性跟腱病急性階段促炎介質表達的影響

吳艷萍 申晉波 王武年

(1蘇州大學體育學院，江蘇 蘇州 215021；2江蘇大學體育部；3太原師范學院體育系)

跟腱是連接小腿后方肌群和跟骨之間的最粗大肌腱，在人體進行不同形式運動時將肌肉力量傳遞至骨骼，然而不適宜的運動方式和運動強度可能引發跟腱病。據統計，約有11%患者因各種運動不當引發跟腱病急性發作，尤其高水平運動員發病率可高達52%，嚴重影響運動人群的運動訓練及生活質量，因而針對跟腱病治療的研究日趨增多〔1，2〕。跟腱病早期主要病理表現為肌腱膠原纖維紊亂，部分斷裂，產生炎癥反應，導致跟腱局部疼痛、腫脹，伴隨時間延長，微損傷不能修復從而誘發慢性跟腱病的發生。在跟腱病炎癥反應過程中，尤其是急性階段，多種促炎介質參與其中，如白細胞介素(IL)-1、IL-6和IL-10、環氧合酶Ⅱ(COX-2)及腫瘤壞死因子(TNF)-α均被激活或者表達水平上調〔3，4〕。另一方面，跟腱病發生發展過程中，腱組織中基質金屬蛋白酶(MMPs)的合成可發生明顯變化〔5〕。促炎介質，如IL-1和TNF-α等，可以刺激腱細胞中MMPs的合成，破壞肌腱基質的重構過程，促進腱組織膠原蛋白Ⅰ和Ⅱ的降解，負面影響腱組織的結構完整性，加重跟腱病的發展。

現階段針對跟腱病急性階段最常見的保守治療方法是應用非甾體抗炎藥物(NSAIDs)進行抗炎鎮痛。然而，NSAIDs對跟腱病的治療有一定的爭議，學者認為NSAIDs藥物僅是減輕了跟腱病炎癥的癥狀表現，但對跟腱病的致病因素沒有任何干預，而且有研究發現NSAIDs鎮痛效果與濃度呈現明顯依賴性，長期應用對運動人群有一定的副作用〔6,7〕。而且，某些NSAIDs藥物的使用還會增加運動人群肌腱病變發展的風險，因此研究者將關注的目光投向物理治療〔8〕。低能量激光治療(LLLT)作為一種物理治療方式已被證實與局部應用NSAIDs藥物相比可獲得更好地抑制炎癥療效，而且有學者提出660 nm波長的 LLLT干預對腱細胞增殖及遷移有著重要的作用〔9〕；另一方面，LLLT還可促進損傷肌腱血管的再生，且對Ⅰ型和Ⅲ型膠原的比例有改善，這些對于肌腱損傷的愈合及生物力學性能恢復都具有重要意義〔10〕。然而，現階段大多數研究關注LLLT對運動員及運動人群慢性跟腱病的治療效果，對于運動員及運動人群跟腱病急性階段LLLT的影響機制研究涉及較少。本研究通過膠原酶注射構建跟腱病急性炎癥階段大鼠模型，試圖通過不同能量密度LLLT干預，探究其對跟腱病急性炎癥過程中涉及的重要促炎介質基因表達及含量的影響，為LLLT在運動員及運動人群跟腱病早期階段應用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1實驗動物及分組 40只雄性健康SD大鼠，體重(260±20)g(購自中國藥科大學實驗動物中心)，分籠飼養，自由飲水、活動。飼料為標準顆粒飼料(中國藥科大學實驗動物中心提供)。隨機分為正常對照(FP；n=4)組、未治療(CN；n=6)組、雙氯芬酸鈉注射治療(DS；n=10)組、10 s-LLLT(LR-1；n=10)組、30 s-LLLT(LR-3；n=10)組。實驗期間保持動物房溫度18～24℃，相對濕度45%～55%，同時保證充足的自然光照。

1.2跟腱病動物模型的建立 為更好地模擬跟腱病急性階段，本實驗采用經典的膠原酶注射建模〔11〕。10%水合氯醛(40 mg/kg)大鼠腹腔內注射麻醉，固定于手術臺，雙側下肢跟腱區剃毛備皮后，常規消毒，鋪無菌洞巾。CN、DS、LR-1及LR-3組動物右側踝關節屈曲 90°觸及跟腱后，注射濃度為0.015 g/mlⅠ型細菌膠原酶(Sigma公司，美國)與 0.9%生理鹽水混合無菌溶液20 μl，注射位置距離跟腱結節跟腱止點2 mm處，對側跟腱不給予任何處理，注射后大鼠放入籠中自由活動，FP組相同部位僅注射相同劑量的磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.3治療干預及動物取材 造模后30 min DS組大鼠肌肉注射雙氯芬酸鈉(注射劑量為2.5 mg/kg)，而LR-1及LR-3術后1 h應用鋁鎵銦磷激光治療儀(Photon Lase Ⅲ，巴西)注射處照射治療，其中治療儀波長660 nm，輸出功率100 mW。LR-1組接受照射的能量密度為35.7 J/cm2，照射時間為10 s；LR-3組接受照射的能量密度為107.1 J/cm2，照射時間為30 s，CN組則不做任何治療。造模后2 h處死所有動物并分離下肢，迅速去除腱圍及相連肌肉后取跟腱組織，液氮-80℃冷凍保存進行后續檢測分析。

1.4采用實時熒光定量聚合酶反應(RT-PCR)技術測定跟腱組織中TNF-α、COX-2、IL-6、IL-10、MMP-3、MMP-9及MMP-13的mRNA表達水平 用Trizol法分組提取跟腱組織總RNA，測純度后進行逆轉錄，隨后將逆轉錄的cDNA稀釋，進行RT-PCR檢測。基因引物序列根據Primer6.0進行設計，引物由上海生物工程公司合成提供：TNF-α上游引物序列(5′-3′)：AAGGAGGTGATCGGTCCCAAC，下游(5′-3′)：CCACTCACGCTGGCTCAG；COX-2上游引物序列(5′-3′)：GCGAGGACCTGAGATCAGAA，下游(5′-3′)：TGATGTCACATGAACTCACAT；IL-6上游引物序列(5′-3′)：GCCTGCTGGTACCCATATGATGG，下游(5′-3′)：ACATACCAAGCACATGGGCAG；MMP-3上游引物序列(5′-3′)：CATCTCTCCCGTTTCCTCAA，下游(5′-3′)：CACGAGGACATCGTGGGTAC；MMP-9上游引物序列(5′-3′)：TTGCAATGTGGATG CAATCC，下游(5′-3′)：GAACTTCCTCCGTGATTCGA；MMP-13上游引物序列(5′-3′)：TGGTCTTCTGATGGGCCTTC，下游(5′-3′)：GTCCAGGGAGCTGCTTTTTC；IL-10上游引物序列(5′-3′)：GAAGAGAACATGGGTGTTGG，下游(5′-3′)：GG GCTTTCGAGACTGGAAGT；β-actin上游引物序列(5′-3′)：TGGCACCACACTTTCTACAAAGAT，下游(5′-3′)：AGCACAGGGTCGGTGAGC。反應條件：55℃ 2 min，95℃ 2 min，95℃15 s，65℃ 1 min，75℃ 15 s，擴增30個循環。

1.5IL-1β及前列腺素(PG)E2酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測 取冷凍標本室溫消融后，將各組跟腱組織剪碎充分勻漿后，依照試劑盒說明書(依科生物，中國)進行檢測。450 nm波長處測量各孔吸光度OD值，通過繪制標準曲線分別求出標本中IL-1β及PGE2含量。

1.6統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行方差分析、Turkey檢驗。

2 結 果

2.1一般情況 造模4組大鼠跟腱注射膠原酶后，局部紅、腫脹、充血，無皮膚破潰，無糜爛等，所有大鼠進入結果分析，實驗整個過程無動物脫失。

2.2造模后急性期各組跟腱組織促炎介質相關基因表達 與FP組相比，CN組跟腱組織中促炎因子TNF-α、COX-2及IL-6基因表達水平均顯著增高(P<0.01，P<0.05)，且與組織基質降解有關的酶MMP-3、MMP-9及MMP-13基因表達水平也顯著增高(P<0.01,P<0.05)。DS、LR-1、LR-3組TNF-α、COX-2及IL-6基因的表達水平均較CN組顯著降低(P<0.05，P<0.01)，LR-3組TNF-α、COX-2及IL-6基因表達水平顯著低于DS和LR-1組(P<0.05)。LR-3組MMP-3明顯低于DS和CN組(P<0.05)。LR-1組和LR-3組MMP-9及MMP-13基因表達水平均較CN和DS組顯著下降(P<0.05)。見表1。CN組及治療干預各組的IL-10基因表達水平均顯著高于FP組(P<0.01)，而且3組治療干預組與CN組相比，均顯著上調了IL-10的表達水平(P<0.01)。見表2。

2.3各組IL-1β及PGE2含量比較 CN組跟腱組織中IL-1β及PGE2含量均顯著高于FP組(P<0.05)。DS、LR-1、LR-3組IL-1β及PGE2含量較CN組明顯下降(P<0.05，P<0.01)。與DS組治療相比，LR-3組IL-1β含量下降更為顯著(P<0.05)。見表2。

表1 各組跟腱組織促炎介質相關基因表達水平

表2 各組IL-10基因水平及IL-1β和PGE2的 含量比較

3 討 論

LLLT已被證實具有抗炎和緩解疼痛、促進慢性創面愈合等作用，且因便捷、有效、安全等諸多優點在運動醫學領域廣泛應用，特別是在肌肉骨骼系統和炎癥性疾病方面。跟腱病致病因素首先造成跟腱組織纖維微損傷，隨后腱組織發生一系列復雜反應，其中早期出現相關炎性因子增加的炎癥反應，后期逐漸退變變性增加，損傷與修復并存，最終導致慢性跟腱病的發生〔12〕。因此研究者們試圖通過對跟腱病急性階段促炎介質的干預，即降低相關炎性因子的水平及抑制促進腱組織基質降解酶活性，如MMP-1、MMP-3等來達到治療的目的〔13〕。因而本實驗采用了膠原酶注射致大鼠跟腱炎急性階段實驗模型，其所導致的跟腱水腫和細胞外基質的急性破壞已被證實與自然跟腱急性損傷相似，被認為是研究跟腱病分子和組織學變化的典型模型。本研究結果提示，LLLT不僅抑制了跟腱病急性期腱組織中相關促炎介質的表達，而且抑制了促進腱組織基質退化發展的相關介質表達。

炎癥對于組織損傷后的修復與再生是有益的，但是炎癥的過度增加則會破壞組織恢復的穩態。IL-1β作為IL-1的一種亞型，是腱組織在炎癥發生過程中最先被動員的細胞因子，研究發現肌腱急性損傷后早期促炎癥因子IL-1β迅速上調并回落，且伴隨著抑炎癥因子IL-4與IL-10的后續性上調，反應炎癥的激活與消退〔14〕。作為最先啟動的炎性因子，IL-1β含量的增加也促進了損傷跟腱中炎性因子IL-6 及TNF-α基因的高水平表達。IL-6在損傷過程后的炎癥反應中起重要作用，肌腱的急性炎癥滑膜中升高的IL-6和IL-1刺激粒細胞和中性粒細胞顯著增加，而且這些炎性因子的存在與運動人群肌腱斷裂后疼痛過程中肌腱炎的進展直接相關。TNF-α則是炎癥條件下由單核-巨噬細胞系產生，當肌腱創傷后它的表達增加，并且可能通過誘導炎癥細胞增加在腱組織退化過程中起重要作用。腱組織中IL-10基因的表達明顯上升，IL-10作為抑炎因子可抑制損傷部位IL-6和IL-8、TNF-α的表達及炎性細胞的遷移，包括巨噬細胞和單核細胞來抑制炎癥。以上結果提示在跟腱病急性期炎癥的發生發展與抑制是并存的，因此DS與LLLT照射均顯著降低促炎性因子水平，包括IL-1β、IL-6及TNF-α，提高了抑炎因子IL-10的表達，有利于急性期炎癥發生發展的控制。然而，LLLT不僅取得了與DS治療相似的效果，而且對促炎因子表達下調及抑炎因子表達上調具有更積極的意義。本實驗結果提示，較高能量照射的LLLT在降低炎性因子、提高抑炎水平方面可能效果更為明顯。

跟腱病傳統NSAIDs治療方式主要是通過調節PGE2的合成，進而發揮抗炎鎮痛作用。而PGE2是花生四烯酸通過COX-2代謝途徑合成的細胞因子，因此在體內PGE2主要是由COX-2來進行調控。本研究中CN組COX-2基因表達上調，PGE2的含量明顯增加。DS組治療后，COX-2基因表達水平明顯下降，PGE2的含量也隨之明顯下降。LLLT取得了與DS組相似的治療效果，這一結果與以往研究者所觀察結果相似〔15〕。提示LLLT抗炎鎮痛作用機制有可能不同于NSAIDs。

Tsai等〔16〕發現NSAIDs藥物布洛芬可導致MMP-1、MMP-8、MMP-9和MMP-13的表達上調從而對肌腱造成損害。本研究中也發現，盡管沒有統計學意義，但是DS組MMP-9及MMP-13的基因表達高于CN組。MMPs在肌腱基質形態中起重要作用，通過它降解膠原和蛋白多糖維系腱組織基質代謝平衡。膠原酶如MMP-1、MMP-8、MMP-13 和MMP-18 降解肌腱基質中最重要的成分膠原；明膠酶MMP-2和MMP-9裂解較小的膠原碎片和明膠；基質蛋白酶 MMP-3、MMP-10、MMP-11、MMP-7、MMP-26和金屬彈性酶MMP-12主要降解糖蛋白和蛋白聚糖，這些酶活性的增加可能對損傷中的肌腱膠原降解及其“愈合過程”產生重要影響〔17〕。本研究結果提示，相較于DS治療，LLLT可以減少炎癥條件下肌腱機械強度的損失，對肌腱組織起到良好保護作用，尤其是在高能量密度時可觀察到較好的結果，這一結果提示LLLT對運動員及運動人群跟腱病的修復具有更好的促進作用。

綜上，跟腱病急性炎癥階段應用660 nm、100 mW的LLLT可達到與NSAIDs相似的抗炎鎮痛效果，尤其是能量密度107.1 J/cm2、照射時間30 s的LLLT可更為有效減輕膠原酶誘導的大鼠跟腱病急性炎癥過程。而且與NSAIDs不同，LLLT還可以有效降低MMPs的表達，有助于肌腱機械性能的保護。LLLT可用于運動員及運動人群跟腱病早期炎癥階段的治療，但相關組織學及力學性質等形態學還有待今后進一步實驗進行驗證。