沉默miR-146a對頸動脈狹窄模型大鼠血管平滑肌細胞活性的影響及機制

池魁 袁濤 孫歡歡 李燁 張金文

(河北醫科大學第二醫院 1血管外科，河北 石家莊 050000；2麻醉科)

頸動脈可以將心臟部位的血液輸送到人體的大腦、頭部、面部中〔1,2〕。當血液中出現沉積物時，就會造成某一個部位的血管變窄，血管壁會隨著病情的嚴重程度越來越窄，當達到完全阻塞血流時，就會誘發腦卒中疾病〔3〕。血管平滑肌細胞是構成平滑肌的一種組織，是較橫紋肌原始的一種肌肉，主要分布在人體內臟器官內，是可以單獨存在的，但是大部分的平滑肌細胞都是成層或者成束分布的。其中平滑肌的細胞骨架系統是比較發達的，主要是由中間絲、密體、密斑組成。細胞周邊部的肌漿中，含有粗細兩種肌絲。研究發現，動脈粥樣硬化、冠脈旁路移植術等的特征均為血管平滑肌細胞增生及異常遷移〔4〕。目前臨床缺乏有效治療頸動脈狹窄的方法，因此發現有效診治頸動脈狹窄具有重要的意義。本研究主要探討沉默miR-146a對頸動脈狹窄模型大鼠血管平滑肌細胞活性的影響及機制。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物：48只SPF級SD大鼠，購自商丘美蘭生物工程有限公司〔動物許可證號：SYXK(豫)2022-0006〕，4～6月齡，平均(4.75±0.95)月齡，體重230～320 g，平均(261.25±42.75)g，光照12 h/d，在濕度25%～36%、溫度為25～27℃的溫度中喂養大鼠1 w。本研究經河北醫科大學第二醫院動物實驗倫理委員會批準通過。

主要試劑：miR-146a(武漢博歐特生物科技有限公司)；流式細胞儀購自(上海然哲儀器設備有限公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑(艾美捷科技有限公司)；L型鈣通道蛋白(CaV1.2)抗體(武漢益普生物科技有限公司，貨號：ATA25947)；CaV1.3抗體(上海恪敏生物科技有限公司，貨號：bs-3932R)；Toll樣受體(TLR)4抗體(武漢菲恩生物科技有限公司，貨號：FNab09837)；髓樣分化因子(MyD88)抗體(蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司，貨號：BD-PT2928)；核轉錄因子(NF)-κB抗體(上海西格生物科技有限公司，貨號：XG-K97299)。

1.2方法

1.2.1慢病毒載體構建 miR-146a表達下調的慢病毒載體構建、大鼠miR-146a序列查找及設計由上海GeneChem公司完成，重組miR-146a上調病毒載體(Lentiviral-mediated-Rbfox1)、miR-146a下調載體(Lentiviral-mediated-Rbfox1-RNAi)由上海GeneChem公司合成，并經測序驗證，病毒滴度為108 TU/ml，制備完成將重組慢病毒載體在-80℃保存。

1.2.2分組及建模 大鼠平均分為4組，其中3組參照鄭文婧等〔5〕的方法造模:36只大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，沿頸部正中間切開，將右頸總動脈分離固定在5 ml注射器針頭上，采用尼龍線將頸總動脈扎緊，然后將針頭抽出，在血流恢復以后將肌肉、皮膚縫合，大鼠喂養6 w后，經血管超聲檢查，手術側右頸總動脈舒張末血流速度60～100 cm/s、峰值血流速度155～170 cm/s說明造模成功。造模成功的3組為模型組、過表達組及沉默組，剩余1組為空白組不做特殊處理。

1.2.3慢病毒轉染 在建模成功后過表達組、沉默組大鼠右側頸動脈注射分別含10 μl Lentiviral-mediated-Rbfox1、Lentiviral-mediated-Rbfox1-RNAi的 miR-146a mimic慢病毒懸液。空白組、模型組大鼠注射等量生理鹽水。1 w后觀察變化。

1.2.4miR-146a基因表達量 采集所有大鼠心室血液，2 000 r/min 4℃離心10 min,收集血清。miRNA采用mirVana PARIS試劑盒提取純化。在室溫下加入取出的500 μl血清樣品等體積變性液,混合均勻，加入同樣多的體積酸性酚氯仿,搖晃30～60 s；離心5 min，14 000 r/min在室溫下操作。把上清液放到另一個管中，加入1.25倍無水乙醇充分混勻，然后加入柱中，離心30 s，12 000 r/min,棄濾液；700 μl加入柱中，清洗1次,12 000 r/min離心30 s，棄濾液；把500 μl加入柱中，清洗2次,12 000 r/min離心1 min；95℃預熱洗脫液60 μl加入柱子中，離心1 min 12 000 r/min,收集miRNA。miR-146a上游引物:5′-GGGTGAGAACTGAATTCCA-3′,下游:5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。U6上游引物:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAA-3′,下游:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。實時熒光定量-聚合酶鏈反應(PCR)提取DNA 0.5 ml血清加等量的裂解液于尖底離心管中，37℃孵育1 h，加入0.1 ml樣品稀釋液。PCR擴增取上述0.02 ml DNA提取液加入分裝好的反應液管中。

1.2.5病理組織學觀察 各組大鼠右側頸動脈注射3.0% 80 mg/kg的戊巴比妥麻醉，迅速取分離鼠右側頸動脈組織，然后將右側頸動脈組織制作成標本，用4%多聚甲醛固定，室溫下用15%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣、脫水后用石蠟進行包埋，作3 μm的切片，最后蘇木素-伊紅(HE)染色處理，采用光學顯微鏡觀察大鼠右側頸動脈病理變化。

1.2.6N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)、同型半胱氨酸(Hcy)水平檢測 采用流式細胞儀分別檢測NMDA、Hcy，進行離心處理(轉速為3 000 r/min,離心5 min)，棄上清，加入100 μl FACS緩沖液，再加入Fc受體抗體0.5 mg/ml，細胞浸泡3 min。加入熒光抗體1 μl(0.5 mg/ml)，水浴30 min。加入350 μl FACS緩沖液,3 000 r/min，輕輕混勻，離心5 min,棄上清，重復2次，洗細胞去除游離的熒光抗體。取100 μl儀器緩沖液加入去除有利細胞的熒光抗體沉淀細胞后，將懸浮細胞移入FACS專用管中進行檢測分析。

1.2.7血管平滑肌細胞的分離培養 將大鼠處死，分離，取雙側骼動脈分權以上2 cm處動脈,刮取血管中膜，然后將血管中膜放置培養皿，剪碎，然后放入含20%胎牛血清的DMEM培養液中培養，5 d換1次液,然后進行檢測。

1.2.8血管平滑肌細胞增殖水平 采用MTT比色法檢測，將血管平滑肌細胞制成單細胞懸液,然后接種4×103個細胞在96孔板中，將20 μl MTT試劑加入后，培養4 h，棄上清，加入150 μl二甲亞礬，搖晃10 min，490 nm波長處的各孔光密度值使用酶標儀查看。

1.2.9血管平滑肌細胞遷移能力檢測 采用細胞劃痕實驗檢測各組血管平滑肌細胞遷移能力，將細胞接種于18孔板中，細胞增長至90%左右時，采用100 μl槍頭垂直劃3條直線，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復清洗3次，每次清洗3 min，加入0.5%血清培養基并觀察24 h，使用倒置顯微鏡觀察各組血管平滑肌細胞遷移能力。

1.2.10CaV1.2、CaV1.3、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白 采用Western印跡法檢測，取大鼠牙髓組織蛋白。煮沸5 min使蛋白變性后用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后依據蛋白分子大小把凝膠切開并轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用Western封閉液把CaV1.2、CaV1.3、TLR4、MyD88、NF-κB和內參U6蛋白封閉90 min在室內,按1∶1 000加到CaV1.2抗體、CaV1.3抗體、TLR4抗體、MyD88抗體、NF-κB抗體，以1∶2 000加入c-fos抗體,孵育過夜4℃，每隔10 min使用洗滌液清洗1次，共5次。按1∶5 000加入稀釋山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G,孵育60 min室溫水平搖勻,每隔10 min使用洗滌液清洗1次，共5次。二氨基聯苯胺(DAB)顯色，定量分析蛋白表達。

1.3統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行F檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1各組miR-146a基因表達量比較 如表1所示，相比于空白組，模型組、過表達組、沉默組miR-146a基因表達量顯著較高(P<0.05)；相比于模型組，過表達組miR-146a基因表達量顯著較高(P<0.05)；沉默組miR-146a基因表達量顯著較低(P<0.05)；相比于過表達組，沉默組miR-146a基因表達量顯著較低(P<0.05)。

2.2各組右側頸動脈組織病理組織學觀察 如圖1所示，空白組內膜光滑，無增厚現象的出現；模型組血管內膜明顯增厚，管腔內已出現狹窄現象；過表達組血管內膜增厚現象嚴重，管腔血管嚴重狹窄現象嚴重，黏膜層增生；沉默組內膜明顯光滑，且幾乎無增厚現象。

2.3各組血管平滑肌細胞活中CaV1.2、CaV1.3、NMDA、Hcy表達情況 如表1所示，相比于空白組，模型組、過表達組、沉默組CaV1.2、CaV1.3、NMDA、Hcy表達顯著更低(P<0.05)；相比于模型組，過表達組CaV1.2、CaV1.3、NMDA、Hcy表達顯著更低，沉默組CaV1.2、CaV1.3、NMDA、Hcy表達顯著較高(P<0.05)；相比于過表達組，沉默組CaV1.2、CaV1.3、NMDA、Hcy表達顯著較高(P<0.05)。

表1 各組血管平滑肌細胞活中CaV1.2、CaV1.3、NMDA、Hcy表達對比

圖1 各組右側頸動脈組織病理觀察(HE染色，×400)

2.4各組血管平滑肌細胞增殖、遷移情況比較 如表2所示，相比于空白組，模型組、過表達組、沉默組增殖顯著較高，遷移顯著較低(P<0.05)；相比于模型組，過表達組增殖顯著較高，遷移顯著較低；沉默組增殖較低，遷移較高，差異有統計學意義(P<0.05)；相比于過表達組，沉默組增殖較低，遷移較高，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組血管平滑肌細胞增殖、遷移情況比較

2.5各組右側頸動脈組織TLR4/MyD88/NF-κB信號通路蛋白表達量比較 如表3、圖2所示，模型組、過表達組、沉默組TLR4/MyD88/NF-κB信號通路蛋白表達量明顯高于空白組，差異具有統計學意義(P<0.05)；過表達組TLR4/MyD88/NF-κB信號通路蛋白表達量明顯高于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)；沉默組TLR4/MyD88/NF-κB信號通路蛋白表達量明顯低于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)；沉默組TLR4/MyD88/NF-κB信號通路蛋白表達量明顯低于過表達組，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表3 各組右側頸動脈組織TLR4/MyD88/NF-κB信號 通路蛋白表達量比較

1～4：空白組，模型組，過表達組，沉默組圖2 各組細胞TLR4/MyD88/NF-κB信號通路 蛋白表達

3 討 論

腦卒中目前是死亡率及致殘率最高的疾病之一〔6〕。頸動脈狹窄可以分為有癥狀性狹窄和無癥狀狹窄，頸動脈狹窄的并發癥主要是和大腦供血減少、斑塊破裂、血液阻滯相關，大腦出現缺氧缺血時就會發生眩暈、頭暈、短暫性失眠及頭暈的癥狀〔7〕。當斑塊破裂之后小血塊就會隨著血流入到大腦中，從而阻塞小動脈血管。血管平滑肌細胞主要分布在人體內臟器官內，平滑肌由中間絲、密體、密斑組成,是構成血管中膜的物質，有著很強的生理功能，可以調節血管的舒張性并維持血管壁的完整性〔8，9〕。平滑肌雖然有類似于肌絲的結構，但是不會像骨骼肌一樣有序的排列。平滑肌細胞中的細肌絲有同骨骼肌類似的分子結構，橫橋的激活開始于它的磷酸化〔10，11〕。平滑肌大都具有自律性，在遇到牽拉時可作為一個整體起反應〔12〕。血管平滑肌細胞可參與動脈狹窄的疾病進展，增強血管平滑肌的細胞活性可以調節血管的舒張性并維持血管壁的完整性，減少張力，進而造成組織器官出現變形。

miRNA是一類由內源基因編碼的單鏈RNA分子，可以在動植物中參與轉錄后的基因表達進行調控，存在形式是基因簇、多拷貝、單拷貝，同時也是一類長度為20～24個核苷酸及內生的小RNA〔13〕。miRNA 與其靶基因的進化有著密切的聯系，有助于進一步了解作用及機制，miRNA還存在于多種機制，miRNA與靶基因完全互補結合后功能、方式非常的相似〔14，15〕。作用時與靶基因不完全互補結合，大鼠體內沉默miR-146a時，大鼠體內的蛋白及基因等都有著變化，可以提高大鼠血管平滑肌細胞活性〔16〕，提示miR-146a的表達水平與頸動脈狹窄可能相關，miR-146a水平的上升提示著頸動脈狹窄的發生，在血管平滑肌細胞活性增加時，就會降低miR-146a水平，從而減少頸動脈狹窄所導致的身體損傷。

血管平滑肌細胞活中的CaV1.2、CaV1.3、NMDA、Hcy都可以參與疾病的進展〔17〕。其中Hcy受體可以誘導平滑肌的細胞遷移和增殖，NMDA受體介導了Hcy誘導的血管平滑肌細胞的遷移和增殖，在中樞神經系統作為Hcy結合受體已被廣泛的研究，Hcy可以活化神經嵴來源的平滑肌細胞〔18，19〕。通過RNA干擾技術沉默大鼠的平滑肌細胞，能夠特異性抑制大鼠血管平滑肌細胞CaV1.2、CaV1.3基因。

TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，TLR4是位于九號染色體的基因，在病原體識別及先天免疫激活中起到很重要的基礎性作用，同時也是具有結構及功能上的優勢，可以很快識別傳染源上表達的病原體相關分子的模式，同時還可作為介導機體免疫力的一種重要細胞因子〔20〕。MyD88處于三號染色體的基因，在適應性免疫應答及先天性中有著重要的關鍵性作用，有著重要的信號轉導作用，可以調節促炎基因的激活。NF-κB是一種蛋白質復合物，可以控制轉錄的DNA，還可以促使細胞存活及細胞因子產生，在所有的動物模型中可以參與細胞的刺激反應，NF-κB也與記憶過程、突觸可塑性有關〔21〕。以上論述說明了抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的信號轉導，可以很好地抑制頸動脈狹窄大鼠的炎癥反應，從而很好的保護頸動脈出現狹窄的發生。

綜上所述，沉默miR-146a對頸動脈狹窄模型大鼠血管平滑肌細胞活性有著干預的作用，其作用機制可能與TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關。