下調lncRNA ZEB1-AS1靶向促進miR-133a-3p表達抑制口腔鱗癌細胞SCC15侵襲和遷移的分子機制

王海琴 閆冰 李成

(西寧市口腔醫(yī)院口腔外科，青海 西寧 810000)

口腔鱗癌是常見的口腔頜面惡性腫瘤，其發(fā)病率在口腔頜面全部惡性腫瘤中占80%，口腔鱗癌的發(fā)病率不斷攀升〔1〕。近些年來，基因在口腔鱗癌中的作用得到了人們的廣泛重視，口腔鱗癌中異常表達的基因參與影響腫瘤細胞的惡性生長和轉移，分子靶向基因治療口腔鱗癌成為近些年研究的熱點〔2〕。長鏈非編碼RNA(lncRNA)的轉錄本大于200 nt，沒有開放閱讀框、起始密碼子、終止密碼子，因此也沒有編碼蛋白質的功能，lncRNA蘊含信息豐富，其在人體組織中的表達具有數(shù)量多、作用模式多、種類多等特點，lncRNA在細胞內的各種活動如細胞分化、細胞生長、染色質修飾等過程中發(fā)揮作用〔3〕。lncRNA鋅指E-盒結合同源異形盒1-反義鏈(ZEB1-AS)1又稱為ZEB1的反義RNA1，其長度為2 232 bp，其首次發(fā)現(xiàn)于肝癌中，后續(xù)在膀胱癌、肺癌等腫瘤中也發(fā)現(xiàn)ZEB1-AS1表達上調，ZEB1-AS1具有促進腫瘤惡性生長的作用〔4～6〕。目前尚不明確ZEB1-AS1在口腔鱗癌細胞生長和侵襲中的作用。前期的預實驗發(fā)現(xiàn)，ZEB1-AS1和miR-133a-3p存在互補結合位點，二者可能互為靶向關系。miR-133a-3p是一個具有抑制口腔鱗癌細胞惡性生長和轉移作用的小分子RNA，其在口腔鱗癌中表達下調〔7〕。本研究旨在探討下調ZEB1-AS1對口腔鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用及作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 口腔鱗癌細胞系CAL27購自上海晶萊生物技術有限公司；E-鈣黏蛋白(cadherin)抗體購自美國Abbkine；口腔鱗癌細胞系HN-6購自上海賓穗生物科技有限公司；口腔鱗癌細胞系SCC15購自美國ATCC；基質金屬蛋白酶(MMP)-2抗體購自北京天根；ZEB1-AS1 shRNA、shRNA control由上海吉瑪構建；N-cadherin抗體購自以色列Alomone；inhibitor control、miR-133a-3p inhibitor購自上海晨曄生物；正常口腔上皮細胞系HOK購自上海榕柏生物技術有限公司；MMP-9抗體購自美國GeneTex；miR-133a-3p mimics、mimics control由北京吉田生物科技有限公司構建。

1.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(Rt-PCR)檢測口腔鱗癌細胞中ZEB1-AS1表達變化 用Trizol試劑提取口腔鱗癌細胞CAL27、HN-6、SCC15及正常口腔上皮細胞HOK內的RNA，RNA放在-80℃保存。制備逆轉錄體系，包括：2 μl的PrimeSLipt mix、2 μl的RNA，最后添加焦碳酸二乙酯(DEPC)水至8 μl，逆轉錄反應的條件為：37℃孵育15 min，85℃孵育5 s，4℃保存。PCR體系如下：2 μl的cDNA、0.4 μl的上游引物、5 μl的SYBR Ⅱ、0.4 μl的下游引物，加入適量的DEPC水至10 μl。PCR條件如下：95℃預變性5 min，95℃變性10 s，60℃孵育1 min，72℃孵育1 min。根據(jù)樣本反應得到的Ct值，以GAPDH作為內參，按照2-△△Ct法計算ZEB1-AS1的表達水平。引物為：GAPDH上游：5′-GTCAACGATTTGGTCTGTATT-3′，下游：5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′，ZEB1-AS1上游：5′-TTCAAACCCATAGTGGTTGCT-3′，下游：5′-TGGGAGATACCAAACCAAC-TG-3′。

1.3細胞轉染和分組 口腔鱗癌細胞SCC15種植到6孔板中，分別把ZEB1-AS1 shRNA及shRNA control至細胞內，依照轉染試劑(Lipofectamine 2000)說明進行轉染。將轉染了ZEB1-AS1 shRNA、shRNA control以后的口腔鱗癌細胞SCC15分別命名為sh-ZEB1-AS1組、sh-NC組，設置沒有進行細胞轉染操作的口腔鱗癌細胞SCC15為Control組。各組細胞在轉染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，根據(jù)1.2中Realtime PCR方法檢測細胞中ZEB1-AS1表達水平。

1.4CCK-8方法檢測細胞增殖 以96孔板，按照每孔接種105個將細胞分成Control組、sh-NC組、sh-ZEB1-AS1組，細胞放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內常規(guī)方法培養(yǎng)24 h。分別在每個孔內小心的加CCK-8溶液(10 μl)，反應4 h(37℃)。然后放在酶標儀上測定波長為450 nm的OD值。計算各組細胞的存活率變化。

1.5利用Transwell小室方法分析檢測細胞的遷移以及侵襲水平 把Control組、sh-NC組、sh-ZEB1-AS1組細胞用不添加胎牛血清的細胞培養(yǎng)液懸浮，細胞密度為每毫升含有105個細胞。將凍存在-80℃冰箱中的基質膠取出，放在4℃過夜。取300 μl的不含血清的細胞培養(yǎng)液，添加60 μl的基質膠，混合后，添加到上室中，置于37℃孵育4 h。于上室緩緩加100 μl的細胞溶液，吸取500 μl細胞培養(yǎng)液至下室，置于37℃條件下孵育24 h。將Transwell小室取出，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，用棉簽把沒有穿過膜的細胞擦掉，然后置于中性的甲醛溶液中孵育15 min。添加結晶紫染色30 min，PBS洗滌，風干以后，將小室放在顯微鏡下進行觀察，計數(shù)細胞穿膜的數(shù)目作為細胞侵襲數(shù)目。在細胞遷移實驗檢測以前需要將基質膠包被的步驟省去。

1.6利用Western印跡分析并檢測N-cadherin、MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白表達 按照100∶1的比例將放射免疫沉淀(RIPA)裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)混合，放在冰上備用。將Control組、sh-NC組、sh-ZEB1-AS1組培養(yǎng)24 h，然后棄掉培養(yǎng)液上清，將配制好的蛋白抽提試劑添加到細胞內，放在冰上裂解20 min，期間每隔3 min吹打1次。12 000 r/min，4℃高速離心10 min，將上清溶液吸取并保存在-80℃。利用二喹啉甲酸(BCA)方法檢測蛋白的濃度。將蛋白溶液和5×上樣緩沖液按照4∶1的比例混合，然后放在100℃加熱5 min，置于-80℃保存。制備12%的分離膠及5%的濃縮膠。每個上樣孔中加入40 μg的蛋白樣品，初始電壓設置為70 V，電泳30 min以后，調整電壓至90 V，電泳到凝膠的底部以后，停止電泳。依照預染蛋白分子量的大小，將對應的膠塊切下，裁剪聚偏氟乙烯(PVDF)膜，把轉膜裝置放在4℃進行，設置300 mA恒流進行常規(guī)轉膜。小心把PVDF膜浸泡于5%牛血清白蛋白配制的封閉液內，然后將裝置置于室溫內、搖床孵育2 h。將一抗按照1∶1 000的比例稀釋，繼續(xù)放置PVDF膜于一抗內，4℃過夜。PVDF膜于1∶5 000稀釋后二抗結合后。電化學發(fā)光(ECL)顯色。利用ImageJ對各個條帶進行灰度值檢測，內參是GAPDH。

1.7ZEB1-AS1靶基因的預測及鑒定 本次實驗利用軟件starbase預測ZEB1-AS1靶基因，將ZEB1-AS1-WT、ZEB1-AS1-MUT分別和mimics control、miR-133a-3p mimics小心的共轉染至口腔鱗癌細胞SCC15內，轉染24 h后，以熒光素酶活性檢測試劑盒對各組細胞的熒光素酶活性進行分析。ZEB1-AS1-WT、ZEB1-AS1-MUT分別為含有ZEB1-AS1結合位點、含有突變以后的ZEB1-AS1結合位點的熒光素酶報告載體。將Control組、sh-NC組、sh-ZEB1-AS1組培養(yǎng)24 h，用Realtime PCR方法檢測細胞中miR-133a-3p表達水平，步驟完全按照1.2中進行，內參為U6。引物為：U6上游：5′-GTCAACGATTTGGTCTGTATT-3′，下游：5′-CTCGCTTTCGGCAGCACA-3′；miR-133a-3p上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGA-CAGCTGG-3′。

1.8miR-133a-3p inhibitor對下調ZEB1-AS1 shRNA口腔鱗癌細胞的作用檢測 在口腔鱗癌細胞SCC15中分別將miR-133a-3p inhibitor、ZEB1-AS1 shRNA和inhibitor control、ZEB1-AS1 shRNA共轉染，命名為sh-ZEB1-AS1+Anti-miR-133a-3p組、sh-ZEB1-AS1+Anti-miR-NC組，細胞培養(yǎng)24 h以后，利用Realtime PCR方法測定miR-133a-3p表達水平(步驟參照1.2)，CCK-8方法分析檢測各細胞的增殖水平(步驟按照1.4中進行)，利用Transwell小室方法分析并檢測各組細胞遷移及侵襲水平(步驟參按照1.5中進行)，利用Western印跡檢測細胞內MMP-2、N-cadherin、MMP-9、E-cadherin蛋白的水平(步驟參按照1.6中進行)。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1ZEB1-AS1在口腔鱗癌細胞中的表達變化 口腔鱗癌細胞CAL27、HN-6、SCC15中ZEB1-AS1水平(1.58±0.13、2.15±0.16、2.78±0.22)均明顯高于正常口腔上皮細胞HOK中ZEBI-ASI水平(1.00±0.12，P<0.05)。ZEB1-AS1在口腔鱗癌細胞中表達上調。口腔鱗癌細胞CAL27、HN-6中ZEB1-AS1水平明顯低于口腔鱗癌細胞SCC15(P<0.05)。選擇表達水平最高的口腔鱗癌細胞SCC15用于后續(xù)實驗。

2.2下調ZEB1-AS1對口腔鱗癌細胞增殖、侵襲和遷移影響 與Control組、sh-NC組比較，sh-ZEB1-AS1組口腔鱗癌細胞SCC15中ZEB1-AS1水平明顯減少，細胞存活率明顯下降，遷移及侵襲數(shù)目明顯降低，蛋白MMP-9、N-cadherin、MMP-2表達水平明顯降低，E-cadherin蛋白表達水平明顯增強(P<0.05)。見圖1、表1。

1～3：Control組,sh-NC組,sh-ZEB1-AS1組圖1 Western印跡檢測各組MMP-2、MMP-9、 N-cadherin、E-cadherin蛋白表達

表1 各組細胞存活率和遷移、侵襲數(shù)目以及MMP-2、N-cadherin、MMP-9、E-cadherin蛋白表達量

2.3ZEB1-AS1和miR-133a-3p互為靶向關系 生物信息學軟件發(fā)現(xiàn)ZEB1-AS1和miR-133a-3p存在互補結合位點。見圖2。miR-133a-3p mimics和WT共轉染以后的熒光素酶活性降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表2。ZEBI-AS1 shRNA轉染后，sh-ZEB1-AS1組口腔鱗癌細胞SCC15中miR-133a-3p水平(1.89±0.16)高于Control組、sh-NC組(1.00±0.10、0.98±0.12)，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

圖2 ZEB1-AS1和miR-133a-3p靶向結合位點

表2 熒光素酶活性

2.4miR-133a-3p inhibitor對下調ZEB1-AS1影響口腔鱗癌細胞SCC15增殖、遷移和侵襲的影響 與sh-ZEB1-AS1+Anti-miR-NC組比較，sh-ZEB1-AS1+Anti-miR-133a-3p組口腔鱗癌細胞SCC15中miR-133a-3p表達明顯減少，而細胞存活率明顯變大，細胞遷移及侵襲數(shù)目明顯增加，細胞內MMP-9、N-cadherin、MMP-2蛋白量明顯變大，E-cadherin蛋白表達明顯減少(均P<0.001)。見表3、圖3。

表3 各組細胞存活率和遷移、侵襲數(shù)目及N-cadherin、MMP-9、E-cadherin、MMP-2蛋白表達比較

1～2:sh-ZEB1-AS1+Anti-miR-NC組,sh-ZEB1-AS1+Anti-miR-133A-3p組圖3 Western印跡檢測兩組MMP-2、MMP-9、 N-cadherin、E-cadherin蛋白表達

3 討 論

腫瘤的惡性生長是一個極為復雜的過程，受到很多基因的表達調控作用。伴隨著基因測序技術的不斷進步和發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)非編碼RNA占人類基因組的98%，而且這些非編碼RNA在細胞發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)、細胞生長等過程中發(fā)揮作用〔8〕。lncRNA是一種大于200 nt的核苷酸轉錄本，絕大多數(shù)的lncRNA在組織中的表達具有組織特異性，lncRNA通過調控表觀遺傳學、細胞質轉運、印跡缺失等發(fā)揮生物學功能〔9〕。最初人們發(fā)現(xiàn)，ZEB1-AS1參與肝癌細胞生長和惡性表型轉化〔6〕。后續(xù)在膠質瘤、胃癌等腫瘤中證明ZEB1-AS1高表達促進腫瘤惡性生長，而下調ZEB1-AS1具有抑制腫瘤進展的功能〔10,11〕。本實驗表明，口腔鱗癌細胞中ZEB1-AS1表達上調，并且下調ZEB1-AS1能夠在體外抑制口腔鱗癌細胞的增殖能力，提示ZEB1-AS1是口腔鱗癌中的促進因子。

腫瘤細胞從原病發(fā)灶脫落，通過降解細胞外基質進入微循環(huán)系統(tǒng)，隨著微循環(huán)系統(tǒng)達到新的組織和器官，形成新的病灶〔12〕。腫瘤轉移的基礎條件之一是細胞外基質降解，MMPs是常見的細胞外基質降解酶，其含有很多蛋白成員，分別能夠將不同的細胞外基質成分降解〔13〕。MMP-2和MMP-9是與腫瘤轉移關系最為密切的MMPs成員，其表達水平升高促進腫瘤轉移〔14〕。還有研究報道顯示，EMT是腫瘤轉移的早期標志，發(fā)生EMT的腫瘤細胞轉移能力也大大增加〔15〕。N-cadherin是間質細胞標志蛋白，其在EMT過程中表達水平上調〔16〕。E-cadherin是上皮細胞標志蛋白，其在EMT過程中表達下調〔17〕。本實驗結果說明，下調ZEB1-AS1降低口腔鱗癌細胞侵襲、遷移和EMT水平。

lncRNA的作用機制復雜，目前研究最多的是其可以通過與miRNA結合發(fā)揮作用，而且在不同的生理以及病理過程中，lncRNA調控的miRNA不同，且lncRNA可以同時影響多個miRNA的表達，一個miRNA也可以同時受到多個lncRNA的調控作用〔18～20〕。本實驗發(fā)現(xiàn)，ZEB1-AS1和miR-133a-3p存在互補結合位點，而且下調ZEB1-AS1靶向促進miR-133a-3p表達，ZEB1-AS1作用機制可能與miR-133a-3p有關。miR-133a-3p是一個長度在20nt左右的非編碼RNA，具有很多生理功能，在人體組織中廣泛表達〔21〕。以前的研究發(fā)現(xiàn)，miR-133a-3p在腫瘤中扮演抑制因子的角色，其能夠抑制卵巢癌、膀胱癌、口腔鱗癌、結腸癌等多種腫瘤細胞的生長〔7,22～24〕。本研究結果提示，下調ZEB1-AS1靶向促進miR-133a-3p表達降低口腔鱗癌細胞生長和轉移能力。

綜上，ZEB1-AS1可能是一個口腔鱗癌促進因子，下調其表達通過靶向促進miR-133a-3p抑制口腔鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲，ZEB1-AS可能是未來口腔鱗癌治療的靶點。現(xiàn)階段對于ZEB1-AS1靶向miR-133a-3p的下游具有機制還不清楚，在以后的實驗中會進行探討。