黃芪甲苷通過miR-126/NF-κB信號通路調控人牙齦成纖維細胞增殖及凋亡的分子機制

陳亞瓊 高鵬 沈慧

(青海紅十字醫院口腔科，青海 西寧 810000)

牙周炎是常見的一種口腔疾病，炎癥、氧化應激等均與牙周炎形成密切相關，人牙齦成纖維細胞(HGFs)是牙周膜與牙齦的主要細胞，可作為牙周支持組織的組成部分，并可誘導牙周組織再生，研究表明阿司匹林、積雪草酸等均可抑制HGFs細胞炎癥反應〔1～3〕。黃芪甲苷屬于豆科草本植物黃芪的主要活性成分，其具有抗炎的作用，并可促進間充質干細胞的成骨分化，研究表明黃芪甲苷可抑制NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白(NLRP)3炎癥小體的活化而抑制人牙周膜細胞的炎癥反應〔4〕。但黃芪甲苷對HGFs損傷的作用尚未闡明。miR-126在高糖誘導的HGFs中表達下調，并可靶向TNF受體關聯因子(TRAF)6而抑制HGFs細胞中炎性因子的分泌〔5〕。核轉錄因子(NF)-κB信號通路被激活后可促進脂多糖(LPS)誘導的HGFs細胞炎癥反應〔6〕。但黃芪甲苷是否可調控miR-126/NF-κB信號通路而參與牙周炎發生過程尚未可知。本文擬研究黃芪甲苷通過miR-126/NF-κB信號通路調控HGFs增殖及凋亡的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 黃芪甲苷購自北京索萊寶科技有限公司(純度≥98%)；NF-κB抑制劑PDTC購自美國Abcam；HGFs購自美國ATCC公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen；Trizol試劑購自北京全式金生物；反轉錄與熒光定量檢測試劑購自北京天根生化；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑、凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma；兔抗人周期素(Cyclin)D1、Cleaved-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體購自美國CST；兔抗人p-p65、磷酸化抑制蛋白κBα(p-IкBα)抗體購自北京百奧萊博；二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.2實驗分組 取對數生長期HGFs(2.5×105個/ml)接種于96孔板(100 μl/孔)，分別加入含有不同濃度(10、20、40 μg/ml)的黃芪甲苷培養液處理24 h〔7〕，分別記為10、20、40 μg/ml黃芪甲苷組。同時將正常培養的HGFs記為NC組。分別將miR-NC、miR-126 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-126轉染入HGFs中，分別記為miR-NC組、miR-126組、anti-miR-NC組、anti-miR-126組。anti-miR-NC、anti-miR-126分別轉染入HGFs后加入含有濃度為40 μg/ml黃芪甲苷的培養液處理24 h，分別記為40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-NC組、40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-126組。anti-miR-126轉染入HGFs后加入NF-κB抑制劑PDTC 20 μmol/L〔8〕與40 μg/ml黃芪甲苷共同處理24 h，記為PDTC+40 μg黃芪甲苷+anti-miR-126組。

1.3MTT檢測細胞增殖 收集各組HGFs(2.5×105個/ml)接種于96孔板(100 μl/孔)，按照MTT試劑盒說明書操作并檢測各孔吸光度值(A值)。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集各組HGFs加入預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后棄上清，按照凋亡檢測試劑盒說明書操作檢測細胞凋亡率。

1.5實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測細胞中miR-126的表達水平 采用Trizol法提取各組HGFs細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。按照qRT-PCR試劑盒說明書操作并檢測miR-126相對表達量。

1.6Western印跡檢測CyclinD1、Cleaved-Caspase-3、p-p65、p-IкBα蛋白表達 提取各組HGFs蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉膜、封閉2 h，分別加入一抗稀釋液(1∶1 000)與二抗稀釋液(1∶2 000)，滴加電化學發光(ECL)顯影后應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.7統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1不同濃度黃芪甲苷對HGFs增殖、凋亡及miR-126表達的影響 與NC組比較，10、20、40 μg/ml黃芪甲苷組細胞活力、CyclinD1蛋白水平及miR-126表達水平升高，凋亡率及Cleaved-Caspase-3蛋白水平降低，差異有統計學意義(均P<0.05)，見表1、圖1、圖2。

2.2miR-126對HGFs增殖、凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-126組miR-126、CyclinD1蛋白及細胞活力升高，Cleaved-Caspase-3蛋白表達及細胞凋亡率下降，與anti-miR-NC組比較，anti-miR-126組miR-126、CyclinD1蛋白及細胞活力下降，Cleaved-Caspase-3蛋白及細胞凋亡率升高，差異有統計學意義(均P<0.05)，見圖3、表2。

表1 不同濃度黃芪甲苷對HGFs增殖、凋亡及miR-126表達的影響

圖1 不同濃度黃芪甲苷對HGFs凋亡的影響

1～4:NC組,10 μg/ml黃芪甲苷組，20 μg/ml黃芪甲苷組，40 μg/ml黃芪甲苷組圖2 各組CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達

1～4：miR-NC組,miR-126組,anti-miR-NC組,anti-miR-126組圖3 Western印跡檢測各組CyclinD1、 Cleaved-Caspase-3蛋白的表達

表2 miR-126對HGFs增殖、凋亡的影響

2.3anti-miR-126減弱黃芪甲苷對HGFs增殖、凋亡的影響 與40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-NC組比較，40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-126組miR-126、CyclinD1蛋白及細胞活力下降，Cleaved-Caspase-3及細胞凋亡率升高，差異有統計學意義(均P<0.05)，見表3、圖4。

表3 anti-miR-126減弱黃芪甲苷對HGFs增殖、凋亡的影響

2.4HGFs中NF-κB信號通路蛋白的表達 與NC組比較，40 μg/ml黃芪甲苷組p-p65、p-IкBα蛋白水平降低(均P<0.05)，anti-miR-126組p-p65、p-IкBα蛋白水平升高(均P<0.05)；與40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-NC組比較，40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-126組p-p65、p-IкBα蛋白水平升高(均P<0.05)，見圖5、表4。

1～2：40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-NC組,40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-126組圖4 Western印跡檢測CyclinD1、 Cleaved-Caspase-3蛋白的表達

1～5：NC組,40 μg/ml黃芪甲苷組，anti-miR-126組,40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-NC組,40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-126組圖5 Western印跡檢測p-p65、p-IкBα蛋白的表達

表4 HGFs中NF-κB信號通路蛋白的表達

2.5NF-κB抑制劑PDTC逆轉anti-miR-126對黃芪甲苷對HGFs增殖、凋亡的影響作用 與40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-126組比較，PDTC+40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-126組細胞活力與CyclinD1蛋白水平升高(均P<0.05)，凋亡率、Cleaved-Caspase-3、p-p65/p-IκBα蛋白水平降低(均P<0.05)，見圖6、表5。

1，2：40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-126組,PDTC+40 μg/ml黃芪甲苷+anti-miR-126組圖6 Western印跡檢測p-p65、p-IкBα、 CyclinD1、Cleaved-Caspase-3蛋白的表達

表5 NF-κB抑制劑PDTC逆轉anti-miR-126對黃芪甲苷對HGFs增殖、 凋亡的影響作用

3 討 論

牙周炎是一種牙周支持組織慢性炎癥性疾病，其主要是由于菌斑微生物感染引起的一種疾病，牙周局部組織中可激活炎癥反應從而破壞牙槽骨，既往研究顯示，藜蘆酸抑制HGFs細胞中LPS誘導的白細胞介素(IL)-6和IL-8產生〔9〕。槲皮素通過抑制NF-κB信號通路抑制HGFs中LPS誘導的炎癥反應〔10〕。冬凌草甲素通過激活過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)γ抑制LPS誘導的HGFs炎癥反應〔11〕。

黃芪甲苷具有抗炎、抗氧化、降血糖等作用，并可保護糖尿病腎臟，研究表明黃芪甲苷可抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡〔12〕。黃芪甲苷可能通過抑制Capase-3表達而抑制細胞凋亡從而減輕大鼠肝星狀細胞氧化損傷〔13〕。本研究結果顯示，黃芪甲苷可明顯增強HGFs活力，并可促進HGFs的增殖及CyclinD1的表達。本研究結果顯示，黃芪甲苷可降低HGFs凋亡率，并可抑制Cleaved-Caspase-3的表達，提示黃芪甲苷可抑制HGFs凋亡。

本研究提示黃芪甲苷可能通過上調miR-126的表達從而發揮作用。miR-126表達上調可減輕LPS誘導的胰腺炎癥損傷〔14〕。芒果多酚可抑制miR-126/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳動物雷帕霉素蛋白(mTOR)軸而減輕結腸炎的炎癥〔15〕。本研究結果顯示，miR-126過表達可明顯提高HGFs活力，而降低細胞凋亡率，抑制miR-126表達可降低HGFs活力，而提高細胞凋亡率。本研究結果顯示，抑制miR-126表達與黃芪甲苷聯合處理后，HGFs活力降低，而凋亡率升高。miR-424過表達可靶向堿性成纖維細胞生長因子(FGF)2而抑制NF-κB途徑從而抑制LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥〔16〕。牙周組織處于炎癥狀態時，NF-κB-p65核內轉后與下游靶基因結合，進而促進IL-6等炎性細胞因子表達〔17〕。姜黃素可通過髓系細胞觸發受體(TREM)2/Toll樣受體(TLR)4/NF-κB途徑促進小膠質細胞M2極化，從而抑制LPS誘導的神經炎癥反應〔18〕。本研究結果顯示，黃芪甲苷可降低HGFs中p-p65、p-IкBα蛋白水平，抑制miR-126表達可提高HGFs中p-p65、p-IкBα蛋白水平，而黃芪甲苷與抑制miR-126表達聯合作用后HGFs中p-p65、p-IкBα蛋白水平升高，提示黃芪甲苷可能通過調控miR-126/NF-κB通路而發揮作用。同時本研究進一步分析顯示，NF-κB抑制劑PDTC、黃芪甲苷與抑制miR-126表達聯合作用后，HGFs活力升高，而凋亡率降低，提示黃芪甲苷可通過miR-126/NF-κB信號通路而發揮作用。

綜上，黃芪甲苷可通過上調miR-126的表達而抑制NF-κB信號通路的活化從而促進HGFs增殖及抑制細胞凋亡，miR-126可能作為黃芪甲苷治療牙周炎的潛在靶點，還可為進一步揭示黃芪甲苷治療牙周炎的分子機制奠定實驗基礎。