葒草苷對腦缺血再灌注大鼠腦組織線粒體自噬的影響

賈冬雪 杜靜 王書華

(1河北北方學院藥學系，河北 張家口 075000；2河北華奧醫(yī)院有限公司；3河北北方學院附屬第一醫(yī)院)

腦卒中是世界范圍內導致死亡和長期殘疾的主要原因之一，其中因腦循環(huán)血管阻塞引發(fā)的缺血性腦卒中最為常見〔1，2〕。當積極采取措施恢復腦缺血區(qū)的血流供應后，缺血腦組織反而受到更嚴重的二次損傷的現(xiàn)象稱為腦缺血再灌注損傷。線粒體是存在于真核生物體內一種細胞器，在細胞多種生命調控活動中均具有至關重要作用，與腦缺血再灌注損傷具有密切關聯(lián)〔3〕。血液供應恢復使得細胞產生大量的活性氧，氧化還原系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)被破壞，活性氧大量蓄積引發(fā)氧化應激損傷，作為活性氧主要來源和首要攻擊目標的線粒體受損嚴重。功能異常的線粒體不僅不能為細胞提供所需的能量，還會觸發(fā)線粒體凋亡通路，最終導致細胞死亡〔4〕。由此可見保證線粒體功能正常對減輕腦缺血再灌注損傷具有重要的意義。

線粒體自噬是一個選擇性包裹受損線粒體形成自噬體并利用溶酶體將其降解的過程，從而避免功能異常的線粒體對細胞造成損傷〔5，6〕。但也有學者發(fā)現(xiàn)血液復灌可導致線粒體自噬過度激活，加重腦缺血再灌注損傷，抑制線粒體自噬對腦組織具有保護作用〔7〕。葒草苷是金蓮花、葒草等中藥植物中的主要有效活性成分，具有抗炎、抗血栓、抑制腫瘤生長等藥理作用〔8〕。前期研究表明，葒草苷可減輕腦缺血再灌注大鼠腦組織損傷，其可能與抗炎、降低興奮性氨基酸對神經細胞毒性、抑制氧化應激損傷等機制有關〔9〕。但葒草苷是否通過調控線粒體自噬發(fā)揮神經保護作用仍不清楚，本實驗通過建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，探討線粒體自噬在葒草苷減輕大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用。

1 材料和方法

1.1實驗動物 SPF級健康SD雄性大鼠，體重250～280 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司。動物許可證號：SCXK(京) 2019-0010。

1.2藥品與試劑 葒草苷(純度：99.60%)，南通飛宇生物科技有限公司生產；雷帕霉素購自美國BioVision公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和鈣離子(Ca2+)含量測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；微管相關蛋白輕鏈3抗體(LC3)，日本MBL公司生產；B細胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)/E1B-19K相互作用蛋白3抗體(BNIP3)，ABclonal公司生產；細胞色素c氧化酶Ⅳ亞型1抗體(COX Ⅳ)，杭州華安生物技術有限公司生產。

1.3儀器 Tacan Safire2多功能酶標儀，奧地利Tecan公司產品；3K30 超速冷凍離心機，德國 Sigma 公司產品；FM0530多色熒光和化學發(fā)光成像系統(tǒng)，ProteinSimple公司產品。

1.4用線栓法制備大鼠局灶性腦中動脈阻斷模型 采用改良Longa線栓法〔10〕制備MCAO模型，在缺血2 h后，慢慢拔出栓線進行血液再灌注。假手術組大鼠只分離血管，不進行插線處理。術后1 h參照Longa 5分制評分法對大鼠進行評分，評分越高，說明大鼠腦損傷越嚴重，評分1～3分表明 MCAO 模型的成功建立。

1.5分組與給藥 將模型制備成功的大鼠隨機分為：模型組、葒草苷組、葒草苷+雷帕霉素組，另取未插線的大鼠為假手術組，每組18只。葒草苷組于術后1 h和12 h腹腔注射6.48 μmol/kg葒草苷溶液2次(課題組前期研究〔11〕證明葒草苷6.48 μmol/kg劑量組對腦缺血再灌注大鼠具有較好的治療效果)，假手術組和模型組給予同等劑量的溶劑和0.9%NaCl混合溶液。葒草苷+雷帕霉素組于術前24 h和30 min給予2.66 mg/ml雷帕霉素溶液兩次〔12〕。

1.6腦缺血再灌大鼠神經功能損傷評分 再灌注24 h后，參照Zea-Longa建立的5分制評分法對各組大鼠進行神經功能缺損評分，通過觀察雙側肢體肌力大小、大鼠肢體動作的協(xié)調性及探索能力，對大鼠的神經功能損傷程度做直觀評估，分數(shù)越高，神經功能損傷越嚴重。0分：大鼠肢體運動正常，無明顯行為學改變；1分：大鼠左前爪蜷曲，不能完全舒展；2分：大鼠左側抗側推能力明顯減弱，肩內收，走路時向左側轉圈；3分：行走時向左側傾斜搖擺不定；4分：意識模糊，不能自發(fā)行走。

1.7TTC法測定腦梗死體積 腦缺血再灌注24 h，深度麻醉后斷頭取腦，按照文獻〔9〕操作進行染色，染色完成后正常組織為紅色，而梗死部分則呈現(xiàn)為白色，放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h后拍照，用ImageJ軟件分析腦梗死體積百分比。為排除腦水腫對腦梗死體積測定結果的影響，采用校正后的公式計算腦梗死體積：腦梗死體積百分比=(缺血側對側正常腦組織體積-缺血側正常腦組織體積)/缺血側對側正常腦組織體積×100%。

1.8分光光度法測定線粒體SOD酶活性及Ca2+和MDA含量 大鼠再灌注24 h，深度麻醉后斷頭取腦，小心分離出缺血側腦皮質，稱取適量的腦組織，剪碎后加入線粒體分離液A(組織：線粒體分離液A=1∶10)制備勻漿液，于700 r/min，4℃條件下離心5 min，小心吸取上清液，于12 400 r/min，4℃條件下離心10 min，離心管底部沉淀即為所需的線粒體，上述操作需在4℃下進行。加入適量的線粒體裂解液(組織：裂解液=1∶2)，反應20 min后，參照測定試劑盒操作說明書測定線粒體中SOD酶活性及Ca2+和MDA含量。

1.9Western印跡測定缺血腦組織中純化線粒體LC3和BNIP3的表達情況 前期處理同1.8，將裂解后的線粒體于13 500 r/min，4℃條件下離心10 min，上清即為所需的線粒體蛋白，測定蛋白濃度后金屬浴變性制備上樣樣品，以COXⅣ表達為內參，通過計算目標蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和BNIP3和內參的比值反映各組蛋白的表達水平。

1.10統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組神經功能損傷評分的測定情況 假手術組肢體運動無明顯改變，評分為0分；與假手術組比較，模型組出現(xiàn)明顯肢體運動障礙，評分明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，葒草苷治療后肢體運動情況明顯改善，評分顯著降低(P<0.05，P<0.01)；與葒草苷組相比，葒草苷+雷帕霉素組神經功能損傷評分升高，但差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組神經功能損傷評分、腦梗死體積、SOD活性、Ca2+和MDA含量及LC3和BNIP3蛋白表達比較

2.2各組腦梗死體積的測定情況 與假手術組相比，模型組腦梗死體積顯著增加(P<0.01)；與模型組比，葒草苷組腦梗死體積明顯降低(P<0.05，P<0.01)；與葒草苷組相比，葒草苷+雷帕霉素組腦梗死體積顯著增加(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 各組腦梗死體積

2.3各組腦組織線粒體SOD酶活性及Ca2+和MDA含量 與假手術組相比，模型組缺血側腦組織的線粒體中SOD酶活性顯著降低(P<0.01)，而MDA和Ca2+含量則明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，葒草苷組明顯增強大鼠腦線粒體中SOD活性(P<0.01)，明顯降低MDA和Ca2+含量(P<0.05，P<0.01)；與葒草苷組比較，葒草苷+雷帕霉素組明顯降低SOD酶活性(P<0.05)，而MDA和Ca2+含量明顯增加(P<0.05)。見表1。

2.4各組腦組織線粒體中LC3和BNIP3蛋白表達 與假手術組相比，模型組缺血側腦組織的線粒體中LC3和BNIP3蛋白的相對表達量顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，葒草苷組腦線粒體中LC3和BNIP3蛋白的相對表達水平明顯降低(P<0.01)；與葒草苷組相比，葒草苷+雷帕霉素能明顯增加大鼠腦線粒體中LC3和BNIP3蛋白的相對表達(P<0.05)。見表1、圖2。

1～4：假手術組、模型組、葒草苷組、葒草苷+雷帕霉素組圖2 各組腦線粒體LC3和BNIP3蛋白表達

3 討 論

線粒體通過氧化磷酸化為細胞提供能量同時，在活性氧(ROS)產生、鈣動態(tài)平衡、細胞周期調節(jié)等生命活動中也具有至關重要的作用〔13〕。ROS是線粒體氧酸磷酸化過程的副產物，在正常生理條件下，ROS的產生和清除處于低水平動態(tài)平衡狀態(tài)，并因其高反應活性參與調控細胞多種生理活動〔14〕。當腦缺血發(fā)生后，腦血管血液供應中斷使得氧氣和葡萄糖向腦組織輸送減少，從而導致線粒體結構異常，氧化磷酸化出現(xiàn)障礙。再灌注期間，氧氣重新輸入引發(fā)的氧化應激反應是引起再灌注損傷的關鍵環(huán)節(jié)，線粒體在其中具有至關重要的作用〔15〕。腦缺血再灌注發(fā)生后，包括低氧、鈣超載在內的多種病理因素導致線粒體氧化磷酸化發(fā)生異常，ROS呈現(xiàn)爆發(fā)式增長，氧化還原系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失衡，線粒體內ROS大量蓄積誘發(fā)氧化應激反應，進一步加重線粒體損傷〔16〕。MDA是線粒體膜脂質過氧化的產物，其含量變化與脂質過氧化過程相對應，因此測定MDA含量可以用作反映線粒體氧化應激水平的指標〔17〕。線粒體是細胞中維持Ca2+動態(tài)平衡的重要細胞器〔18〕。缺血再灌注發(fā)生后氧化磷酸化反應障礙，Ca2+通過多種機制進入細胞內，線粒體通過鈣單向轉運蛋白吸收胞質內過多的Ca2+導致線粒體內Ca2+超載〔19〕。線粒體鈣超載可導致線粒體通透性轉換孔異常開放，線粒體內凋亡相關蛋白釋放到胞質中，介導激活線粒體凋亡通路，最終導致細胞死亡〔20〕。本實驗研究結果顯示葒草苷可降低MCAO大鼠的神經功能評分和腦梗死體積，減輕大鼠腦組織損傷，這與王曉茹等〔12〕研究結果相吻合。此外本實驗還發(fā)現(xiàn)葒草苷可減輕線粒體氧化應激對線粒體損傷，抑制線粒體鈣超載現(xiàn)象，改善大鼠腦損傷后的線粒體功能，這提示葒草苷對腦缺血再灌注大鼠腦保護作用與抑制線粒體氧化應激和鈣超載，改善線粒體功能有關。本研究還發(fā)現(xiàn)在原有葒草苷的基礎上額外給予自噬誘導劑雷帕霉素干預后，葒草苷對腦缺血再灌注大鼠的神經保護作用減弱，而且相關指標結果也顯示，葒草苷對線粒體功能保護作用也遭到破壞，提示葒草苷對線粒體的保護作用可能有線粒體自噬的參與。

自噬相關蛋白(Atg)8家族蛋白成員與磷脂酰乙醇胺(PE)的結合是自噬體形成的關鍵環(huán)節(jié)，LC3是Atg8蛋白家族的重要組成成員〔21〕。自噬發(fā)生時，LC3-Ⅰ與PE耦聯(lián)形成LC3-Ⅱ，后者參與自噬體膜的延伸〔22〕。LC3-Ⅰ轉化為LC3-Ⅱ被認為是自噬激活的標志，常用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值反映自噬發(fā)生水平。BNIP3是存在于線粒體外膜上的蛋白，作為缺氧誘導因子1α的靶標，在缺血缺氧的情況下高表達。研究發(fā)現(xiàn)BNIP3表達上調可以介導線粒體自噬激活，其包含的LIR結構域可與LC3結合，誘導線粒體自噬發(fā)生，清除腦缺血再灌注后受損的線粒體〔23～25〕。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)葒草苷可通過抑制自噬過度激活來減輕大鼠腦組織損傷〔12〕。雷帕霉素是一種常用的自噬誘導劑，通過抑制雷帕霉素靶蛋白mTOR活性誘導自噬發(fā)生，可與藥物聯(lián)用驗證藥物對自噬的作用〔26〕。研究結果顯示，腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織線粒體中BNIP3和LC3的相對表達顯著增加，這與杜肖〔27〕的實驗結果一致。給予葒草苷治療后BNIP3和LC3蛋白相對表達均顯著降低，而在葒草苷的基礎上額外給予雷帕霉素時，葒草苷對LC3和BNIP3蛋白表達的影響被逆轉，進一步說明葒草苷可抑制線粒體自噬。Wu等〔28〕研究發(fā)現(xiàn)電針預處理可明顯降低大鼠腦組織中LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達相對下降，降低腦梗死體積和含水量，而自噬誘導劑雷帕霉素逆轉了電針預處理對LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達降低及神經保護作用，本實驗結果與其一致。

綜上所述，葒草苷可通過降低線粒體自噬過度表達來抑制線粒體氧化應激和鈣超載，改善腦缺血再灌注大鼠線粒體功能損傷從而發(fā)揮腦保護作用。