曲馬多對坐骨神經痛大鼠脊髓c-jun、c-fos表達及星形膠質細胞活化的影響

胡濱 王大斌 鄭潔

(1瀘州市人民醫院疼痛科，四川 瀘州 646000；2西南醫科大學附屬中醫醫院麻醉科)

坐骨神經痛為坐骨神經循行及分布區域持續性、陣發性疼痛的一種神經病理性疼痛(NP)，由椎間盤突出、腰椎退行性病變引起〔1〕。坐骨神經痛發病率較高，是臨床研究的熱點之一〔2〕。研究發現，星形膠質細胞活化與NP關系密切，而抑制星形膠質細胞活化并阻斷其級聯反應是臨床疼痛治療和鎮痛藥物研發的關鍵〔3〕。研究證實，Jun原癌基因(c-jun)與Fos原癌基因(c-fos)可組成二聚體復合物-活化蛋白(AP)-1〔4〕，而AP-1不僅可通過調節星形膠質細胞活化標志物膠質纖維酸性蛋白(GFAP)表達，促進星形膠質細胞活化增生〔5〕，還可通過調控細胞生存、凋亡、炎癥等通路相關基因表達，參與多種NP發生過程〔6〕。故探究c-jun/c-fos通路的調控作用可能有利于闡明星形膠質細胞參與坐骨神經痛發生過程的分子機制。曲馬多又名反胺苯環醇，為一種中等強度的中樞鎮痛藥，其耐藥性和成癮性較小，可廣泛應用于各種原因引起的急慢性中重度疼痛〔7〕，但曲馬多緩解患者疼痛癥狀的分子生物學機制還不甚明確，且曲馬多對坐骨神經痛患者的改善作用報道較少。本研究推測曲馬多可能通過調控c-jun/c-fos通路蛋白表達抑制星形膠質細胞活化，進而緩解坐骨神經痛疼痛癥狀，并建立大鼠坐骨神經痛模型驗證上述推測。

1 材料及方法

1.1實驗動物 健康清潔級SD雄性大鼠，體重200～220 g，購自廣東省醫學實驗動物中心〔SCXK(粵)2018-0002〕。本研究經醫院動物倫理委員會審核批準〔IACUC-01(20160917)〕。大鼠于瀘州市人民醫院動物房中飼養。

1.2主要試劑及儀器 曲馬多(規格：1 mg，性狀：干粉，天津阿斯爾生物，貨號：M9-34)；前列腺素(PG)E2酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號：R31545，上海圻明生物科技有限公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(上海聯邁生物，貨號：LMO105)；P物質(SP)ELISA試劑盒(貨號：CSB-E08361r，上海振譽生物科技有限公司)；兔抗膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、c-fos、c-jun、激活子蛋白(AP)-1、白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、一氧化氮合酶(iNOS)抗體及山羊抗環氧化酶(COX)-2抗體(貨號：分別為ab7260、ab134122、ab32385、ab230273、ab215288、ab200478、ab136918、ab23672，購自美國Abcam)；蛋白電泳儀、半干轉膜儀(型號1659001、Trans-Blot SD，美國Bio-Rad)等。

1.3模型構建與藥物干預 坐骨神經痛模型構建方法如參照文獻〔8〕所述：大鼠置于無菌操作臺中，腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠，在距尾根部1 cm處切下鼠尾，縫合傷口，切開鼠尾椎間盤，取0.5 mg膠凍樣髓核備用。將大鼠置于俯臥位固定于手術臺上，無菌條件下行背正中切口，于L5棘突旁5 mm處切開肌肉層，暴露L5～6間孔外神經，將0.5 mg髓核漿涂抹黏于此神經上，誘發神經炎性反應，逐層縫合肌肉、筋膜，用青霉素3萬U術野肌內注射并縫合皮膚后正常飼養。術后3 d，若觀察到大鼠出現活動頻繁、激惹行為增加且熱刺激反應潛伏期(PWL)及機械痛敏閾值(PWT)檢測結果異常，則為造模成功。將成功造模的大鼠隨機分為曲馬多低(10 mg/kg)、中(20 mg/kg)、高(30 mg/kg)劑量組、陽性對照組(吲哚美辛，7.5 mg/kg)和模型組，每組10只；另取10只大鼠作為假手術組，除制備髓核、暴露L5～6間孔外神經不黏附髓核后，剩余操作與模型組一致。術后第3天，曲馬多各劑量組及吲哚美辛陽性對照組按10 ml/kg的容積灌胃給藥，以生理鹽水溶解稀釋成1.00、2.00、3.00 mg/ml曲馬多溶液和0.75 mg/ml吲哚美辛溶液，其劑量參照文獻〔9，10〕設置；模型組和假手術組給予等容積生理鹽水灌胃，1次/d，連續14 d。

1.4一般行為觀察、PWT及PWL檢測 各組大鼠均于末次給藥后24 h，觀察大鼠活動狀況后，參照文獻〔10〕采用觸覺測痛儀及熱輻射刺激儀測定各組大鼠PWT及PWL值。

1.5標本采取及血清疼痛標志物PGE2、SP水平檢測 將各組大鼠麻醉，取腹主動脈血3 ml，3 000 r/min離心10 min，根據PGE2、SP ELISA試劑盒說明檢測上清液PGE2、SP水平。斷頭處死大鼠，迅速解剖出手術同側的L5段脊髓，于距L5脊髓髓核植入處前后約1.5 cm處割斷脊髓，取出約3 cm的脊髓組織，剪取0.5 cm凍存，其余組織立即于多聚甲醛(4%)固定24 h后備用。

1.6各組脊髓HE染色及星形膠質細胞活化標志物GFAP免疫組化法檢測 將1.4固定的脊髓組織制備成5 μm厚的石蠟切片。依據HE試劑盒說明書對部分切片進行染色、脫水、透明、封片，光學顯微鏡下觀察脊髓組織病理變化。取剩余部分切片，脫蠟、水化及抗原修復后，與一抗抗體(GFAP，1∶500)室溫孵育過夜；添加羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫下孵育2 h，加二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑，蘇木精溶液復染，然后透明、封片。在400倍光鏡下隨機取5個視野，應用Image Pro Plus5.0系統進行半定量分析，結果表示為5個視野陽性表達的平均光密度值。

1.7Western印跡測定脊髓組織c-jun、c-fos、AP-1、TNF-α、IL-1β、iNOS、COX-2蛋白水平 將1.4中凍存的脊髓組織進行勻漿，離心后，取上清液，提取并測定蛋白濃度。取50 μg蛋白進行電泳，轉膜后用脫脂奶粉(5%)于37℃封閉2 h，加入c-fos(1∶1 000)、c-jun(1∶1 000)、AP-1(1∶1 000)、TNF-α(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)、iNOS(1∶1 000)、COX-2(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000)一抗，4℃孵育過夜；加入羊抗兔或羊抗鼠二抗溶液(1∶1 000)，室溫孵育2 h，增強化學發光法顯色后拍照，最后用Image-J軟件分析蛋白表達。

1.8統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1曲馬多影響一般行為 假手術組活動正常；模型組飲食量及活動量降低，出現易激惹行為；曲馬多低、中、高劑量組及陽性對照組易激惹行為減少。

2.2曲馬多影響PWT、PWL 模型組與假手術組相比，PWT、PWL顯著降低(P<0.05)。曲馬多低、中、高劑量組及陽性對照組與模型組相比，PWT、PWL顯著升高(P<0.05)；曲馬多高劑量組與陽性對照組相比，PWT、PWL差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3曲馬多對血清疼痛指標的影響 與假手術組相比，模型組血清PGE2、SP水平顯著升高(P<0.05)。曲馬多低、中、高劑量組及陽性對照組與模型組相比，血清PGE2、SP水平顯著降低(P<0.05)；曲馬多高劑量組與陽性對照組相比，PGE2、SP水平差異無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組PWT、PWL、PGE2、SP、GFAP平均光密度值比較分，n=10)

2.4曲馬多對脊髓組織病理形態的影響 假手術組脊髓組織結構正常，神經纖維整齊排列。模型組大鼠神經纖維排列紊亂，軸突及髓鞘崩解，空泡變性較多。曲馬多低、中、高劑量組及陽性對照組大鼠可見神經纖維逐漸連續，軸突生長良好，且隨著曲馬多劑量升高上述損傷情況改善明顯。見圖1。

圖1 各組脊髓組織病理形態(HE染色，×200)

2.5曲馬多對脊髓組織GFAP表達的影響 圖2中棕色表示GFAP陽性表達，即活化星形膠質細胞。與假手術相比，模型組脊髓內GFAP表達水平顯著升高(P<0.05)；曲馬多低、中、高劑量組及陽性對照組與模型組相比，GFAP表達水平降低(P<0.05)，陽性對照組與曲馬多高劑量組相比，GFAP表達變化差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖2。

2.6曲馬多對脊髓組織c-fos、c-jun、AP-1、iNOS、COX-2蛋白表達的影響 與假手術組相比，模型組脊髓組織c-fos、c-jun、AP-1、iNOS、COX-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，曲馬多組脊髓組織c-fos、c-jun、AP-1、iNOS、COX-2蛋白表達均降低(P<0.05)；陽性對照組與曲馬多高劑量組相比，c-fos、c-jun、AP-1、iNOS、COX-2蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、圖3。

2.7曲馬多影響脊髓內炎癥因子蛋白表達 模型組與假手術組相比，TNF-α、IL-1β蛋白表達顯著升高(P<0.05)；曲馬多組與模型組相比，脊髓內TNF-α、IL-1β蛋白表達均顯著降低(P<0.05)；陽性對照組與曲馬多高劑量組相比，TNF-α、IL-1β蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、圖4。

表2 各組脊髓組織c-fos、c-jun、AP-1、iNOS、COX-2、TNF-α及IL-1β蛋白表達水平

1～6：假手術組、模型組、曲馬多低劑量組、曲馬多中劑量組、曲馬多高劑量組、陽性對照組；圖4同圖3 各組脊髓組織c-fos、c-jun、AP-1、iNOS、 COX-2蛋白表達

圖4 各組脊髓組織TNF-α、IL-1β蛋白表達

3 討論

坐骨神經痛常見致病因素為腰椎間盤突出，且髓核突出并沖破椎間盤纖維環束縛，引起鄰近神經根炎性免疫刺激，是腰椎間盤突出是坐骨神經痛疼痛發生的主要機制之一〔11〕。于大鼠椎間孔外口植入髓核可模擬人體椎間盤突出引起的坐骨神經痛，且創傷小、操作簡單、大鼠機械痛敏穩定〔8〕。本研究結果提示大鼠出現疼痛癥狀，表明造模成功。研究證實炎癥是引起神經損傷和神經疼痛的重要原因〔2〕。羅強等〔12〕發現血清PGE2水平不僅能刺激椎間盤組織產生炎癥反應，還能增加組織對各種致痛因子的敏感度并刺激組織釋放SP等致痛因子，導致機體感覺神經末梢產生并傳導疼痛。本研究提示，模型組大鼠出現炎癥因子、疼痛因子升高及脊髓損傷現象。曲馬多為新型阿片非麻醉性鎮痛藥，其鎮痛效果顯著，成癮性及不良反應較小，已被臨床應用于治療多種疼痛〔7〕。王宇飛等〔13〕發現曲馬多聯合普瑞巴林治療老年帶狀皰疹后神經痛效果較好。本研究發現，曲馬多可緩解坐骨神經痛大鼠疼痛癥狀，改善神經炎性損傷，以高劑量最優，但其改善坐骨神經痛大鼠疼痛癥狀的具體分子機制還不明確。

鎮痛機制主要涉及抑制炎癥通路激活及星形膠質細胞活化、促進神經受損修復等，其中星形膠質細胞活化與神經疼痛機制的關系逐漸受到臨床研究的重視〔14〕。GFAP可作為星形膠質細胞激活的重要標記物〔15〕。趙亮等〔16〕發現坐骨神經痛模型大鼠中存在星形膠質細胞活化即GFAP表達的升高。本研究提示，坐骨神經痛大鼠脊髓組織星形膠質細胞活化增加。近來研究發現“應激性傳感器”c-fos可快速對外界刺激作出反應，并通過亮氨酸拉鏈與c-jun結合成AP-1轉錄因子〔17〕，AP-1不僅可調節GFAP表達〔5〕，還可誘導炎癥因子釋放并促進神經炎性損傷〔18〕。另外，星形膠質細胞中c-fos蛋白也可誘導TNF-α、IL-1β、iNOS和COX-2等炎癥和免疫反應相關物質大量表達〔19〕，其中COX-2可上調PGE2表達參與神經炎性疼痛；NOS可促進NO彌散至細胞內和細胞外引起痛覺過敏。另有研究顯示，IL-1β拮抗劑和COX-2抑制劑可減少疼痛標志物SP合成〔20〕。韓磊等〔8〕發現坐骨神經痛模型大鼠背根神經節內iNOS及COX-2表達增高，提示坐骨神經痛疼痛癥狀可能與iNOS/COX-2/PGE2/SP高表達有關。本研究推測神經元受到病理刺激后，c-fos迅速感應外界刺激，一方面與c-jun結合，形成AP-1轉錄因子，促進星形膠質細胞活化并誘導TNF-α、IL-1β炎癥因子釋放而促進神經炎癥損傷，另一方面誘導iNOS和COX-2表達并調控疼痛物質PGE2或SP的釋放，使機體感覺神經末梢產生并傳導疼痛，這可能是c-fos/c-jun參與星形膠質細胞活化、炎癥損傷、疼痛傳導的主要機制。本研究提示，曲馬多可降低c-fos/c-jun通路相關蛋白表達，可能與減輕疼痛、神經炎癥損傷及星形膠質細胞活化有關，表明曲馬多可能通過抑制c-fos/c-jun通路激活，抑制星形膠質細胞活化，緩解坐骨神經痛模型大鼠神經炎癥損傷及疼痛癥狀。

綜上，坐骨神經痛可通過抑制c-fos/c-jun通路激活，抑制星形膠質細胞活化，緩解坐骨神經痛模型大鼠神經炎癥損傷及疼痛癥狀，為臨床治療坐骨神經痛和闡明曲馬多發揮鎮痛的可能生物學機制提供一定參考。但c-fos/c-jun通路靶向關系及分子調控作用與星形膠質細胞活化的機制較復雜，可能涉及其他機制共同作用，有待后續研究。