miR-212-5p調控NF-κB影響CSE誘導的MRC-5細胞炎癥因子釋放和凋亡

陸輝志 付守芝 譚赟 曹松 董輝 楊璐瑜

(武漢市第三醫院重癥醫學科，湖北 武漢 430071)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種常見的可預防、可治療的疾病，有害顆粒或者氣體造成的肺組織及呼吸道中慢性炎癥是其發生的重要原因〔1〕。與COPD發生有關的靶細胞有多個，其中肺成纖維細胞和氣道重塑關系密切〔2〕。在正常生理狀態下，多數的肺成纖維細胞處于靜息狀態，而受到病理條件的刺激以后，肺成纖維細胞向炎癥部位聚集，產生大量的炎癥因子和炎癥介質，同時細胞凋亡水平增加，造成組織損傷〔3〕。吸煙是誘導COPD發生的致病因素之一，肺成纖維細胞對香煙的煙霧較為敏感，香煙煙霧提取物(CSE)能夠抑制肺成纖維細胞增殖，誘導細胞分泌炎癥因子，促進細胞凋亡，造成細胞損傷〔4〕。微小RNA(miRNA)在人體內的幾乎所有組織中均有表達，miRNA具有多種作用，參與生命體正常生理和病理過程，如細胞生長、凋亡、分化、代謝、糖尿病、腫瘤等〔5,6〕。miR-212-5p參與癌癥、帕金森的發生〔7,8〕。有研究表明，miR-212-5p能夠抑制心臟成纖維細胞增殖，在心肌纖維化中發揮抑制作用〔9〕。既往實驗發現，miR-212-5p與COPD有關，miR-212-5p在COPD中表達下調，其能夠抑制CSE誘導的氣道上皮細胞凋亡〔10〕。目前對于miR-212-5p在CSE誘導的肺成纖維細胞炎癥因子分泌和凋亡中的作用還不明確。本研究旨在探討miR-212-5p在CSE誘導的肺成纖維細胞炎癥因子分泌和凋亡中的作用和機制。

1 材料與方法

1.1材料 C-半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；腫瘤壞死因子(TNF)-α含量檢測試劑盒購自深圳市科潤達生物工程有限公司；核因子(NF)-κB p65抗體購自美國Abcam；人胚肺成纖維細胞(MRC-5)購自無錫欣潤生物科技有限公司；白細胞介素(IL)-8含量檢測試劑盒購自上海康朗生物科技有限公司；miR-212-5p mimics和mimics control購自百奧邁科生物技術有限公司；IL-1β含量檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.2實驗分組處理 MRC-5培養在含有10 ml/L鏈霉素和青霉素、10%胎牛血清的MEM細胞培養液中，細胞放在含有5%CO2、37℃的培養箱內培養，每48 h更換一次細胞培養液，細胞密度生長至70%以上，添加0.25%的胰蛋白酶消化傳代。MRC-5中轉染miR-212-5p mimics和mimics control，培養12 h以后，更換成含有5%的CSE細胞培養液繼續培養，分別命名為CSE+miR-212-5p組和CSE+miR-NC組。細胞轉染方法按照脂質體轉染試劑Lipofectamine2000的操作說明書進行。將沒有轉染的MRC-5細胞用含有5%的CSE細胞培養液培養，命名為CSE組。把正常培養的MRC-5細胞設置為Control組。CSE的制備方法參照文獻〔4〕，以煙霧發生器用去過濾嘴香煙負壓抽吸，在出煙口的位置連接一根導管，使煙霧進入MEM中，然后用NaOH及HCL將pH調整到7.4，以0.22 pm的濾器過濾之后，為100%的CSE，在實驗時根據要求稀釋成5%的CSE。

1.3miR-212-5p表達檢測 用實時熒光定量PCR(qPCR)方法檢測miR-212-5p表達。對照組、CSE組、CSE+miR-NC組、CSE+miR-212-5p組細胞培養24 h以后，在細胞內添加Trizol，分別提取各組細胞中的總RNA。用TE溶液對分光光度計進行校正，然后檢測提取的RNA的OD260和OD280的比值。取RNA，進行逆轉錄反應，配制的逆轉錄反應體系如下：1 μg的RNA、1 μl的oligo(dT)中添加RNase free water至10 μl，在65℃反應5 min，然后繼續加入1 μl的RNase抑制劑、1 μl的RT-primer、2 μl的dNTP mix，在42℃反應60 min，70℃反應5 min，4℃保存。PCR引物序列為：U6上游引物：CGAGCAGAGTCGCTTCA，下游：CTCGCTTCGGCAGCACATAT；miR-212-5p上游引物：CCTCGACTGGGGGTGTAAACAT，下游：-GTGGAGTCGATTGCGTGTC-3。收集1 μl的cDNA，添加0.5 μl的上游引物和下游引物、10 μl的SYBR Green master mix、8 μl的無水RNase，在95℃預變性8 min，95℃反應30 s，95℃反應5 s，60℃反應30 s，共進行40個循環。結果按照2-△△Ct法計算miR-212-5p的表達變化，U6為內參。

1.4細胞分泌炎癥因子檢測 用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測炎癥因子IL-1β、IL-8、TNF-α水平。對照組、CSE組、CSE+miR-NC組、CSE+miR-212-5p組細胞培養24 h以后，收集細胞培養液上清，用IL-1β含量檢測試劑盒、IL-8含量檢測試劑盒、TNF-α含量檢測試劑盒測定培養液上清中IL-1β、IL-8、TNF-α水平。

1.5細胞增殖活性檢測 用CCK-8法檢測細胞增殖活性。MRC-5接種到96孔板中，接種的密度為4×105個/ml，每個孔內添加150 μl的細胞懸浮液。按照對照組、CSE組、CSE+miR-NC組、CSE+miR-212-5p組分組方法處理并培養24 h以后，將細胞培養板取出，然后吸取10 μl的CCK-8工作溶液添加到每個孔內，將培養板再次放在37℃的培養箱內培養2 h。將酶標儀的波長設置為450 nm，測定每個孔的OD值，OD值表示細胞增殖活性。

1.6細胞凋亡變化檢測 用流式細胞術檢測細胞凋亡變化。對照組、CSE組、CSE+miR-NC組、CSE+miR-212-5p組細胞培養24 h以后，用胰蛋白酶消化細胞，2 600 r/min離心10 min后，將細胞收集，在細胞沉淀內添加適量的磷酸鹽緩沖液(PBS)將細胞反復洗滌2次，然后在細胞內添加結合緩沖溶液400 μl，繼續添加膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)工作溶液各5 μl，避光反應20 min以后，將細胞置于流式細胞儀中檢測凋亡水平。

1.7Western印跡檢測細胞中C-Caspase-3、NF-κB p65蛋白表達 空白組、CSE組、CSE+miR-NC組、CSE+miR-212-5p組細胞培養24 h以后，用胰蛋白酶消化細胞，2 600 r/min離心10 min后，將細胞收集。在細胞內添加提前加入PMSF的放射免疫沉淀法(RIPA)溶液，然后放在冰上充分裂解30 min。將裂解溶液轉移到4℃離心機中，設置2 600 r/min離心10 min，將上清溶液收集并保存，蛋白存在于上清溶液中。吸取少量的蛋白溶液，用二喹啉甲酸(BCA)方法測定蛋白的濃度以后，在剩余的蛋白溶液中添加上樣緩沖液，煮沸5 min。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳電壓設置為：濃縮膠80 V，分離膠100 V，溴酚藍染料跑到底部之后，停止電泳。將凝膠取出并洗滌，放在轉移緩沖液中浸泡。將聚偏氟乙烯(PVDF)膜根據目的蛋白在凝膠中的位置裁剪，同樣浸泡在轉移緩沖液中平衡。在冰上以60 V的電壓轉膜30 min。將PVDF膜取出，然后放在已經添加5%牛血清白蛋白的容器內，在室溫中結合2 h。PVDF膜經TBST洗滌以后，再放在含有稀釋以后的一抗孵育袋中，于4℃溫度條件下結合過夜。再次用TBST將PVDF膜取出，然后放在含有稀釋以后的二抗孵育袋中，在室溫中結合2 h。按照電化學發光(ECL)顯色試劑盒顯色。GAPDH作為參照，分析目的蛋白的表達差異。

1.8NF-κB信號激活劑對miR-212-5p的作用檢測 取轉染miR-212-5p mimics以后的MRC-5細胞，用含有1 μmol/L的NF-κB信號激活劑PMA和5%的CSE細胞培養液培養，命名為CSE+miR-212-5p+PMA組，以CSE+miR-212-5p組為參照，利用ELISA(按照1.4中步驟操作)、CCK-8(按照1.5中步驟操作)、流式細胞術(按照1.6中步驟操作)、Western印跡法(按照1.7中步驟操作)分別檢測細胞分泌的IL-1β、IL-8、TNF-α水平和細胞增殖、凋亡及C-Caspase-3、NF-κB p65蛋白表達變化。

1.9統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1miR-212-5p mimics提高CSE誘導的MRC-5細胞中miR-212-5p表達水平 CSE組MRC-5細胞中的miR-212-5p表達水平明顯低于對照組(P<0.05)；CSE+miR-212-5p組MRC-5細胞中的miR-212-5p表達水平明顯高于CSE+miR-NC組(P<0.05)。見表1。

2.2miR-212-5p對CSE誘導的MRC-5細胞炎癥因子表達影響 CSE組MRC-5細胞分泌的IL-1β、IL-8、TNF-α水平明顯高于Control組(P<0.05)；CSE+miR-212-5p組MRC-5細胞分泌的IL-1β、IL-8、TNF-α水平明顯低于CSE+miR-NC組(P<0.05)。見表1。

2.3miR-212-5p對CSE誘導的MRC-5細胞增殖和凋亡影響 與Control組比較，CSE組MRC-5細胞增殖活性明顯降低，細胞凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與CSE+miR-NC組比較，CSE+miR-212-5p組MRC-5細胞增殖活性明顯升高，細胞凋亡率明顯、C-Caspase-3蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見表1、圖1、圖2。

表1 miR-212-5p mimics轉染以后CSE誘導的MRC-5細胞miR-212-5p表達、分泌的IL-1β、IL-8、TNF-α水平、增殖活性、 凋亡率、NF-κB p65蛋白和C-Caspase-3蛋白水平

圖1 流式細胞術檢測MRC-5細胞凋亡

1～4：Control組，CSE組，CSE+miR-NC組，CSE+miR-212-5p組，圖3同圖2 Western印跡檢測MRC-5細胞中 C-Caspase-3蛋白表達

2.4miR-212-5p對CSE誘導的MRC-5細胞NF-κB信號通路的影響 CSE組MRC-5細胞中NF-κB p65蛋白表達水平明顯高于Control組(P<0.05)；CSE+miR-212-5p組MRC-5細胞中NF-κB p65蛋白表達水平明顯低于CSE+miR-NC組(P<0.05)。見表1、圖3。

圖3 Western印跡檢測各組NF-κB p65蛋白表達

2.5NF-κB信號激活劑對miR-212-5p影響CSE誘導條件下MRC-5細胞增殖、凋亡和分泌炎癥因子的作用 與CSE+miR-212-5p組比較，CSE+miR-212-5p+PMA組細胞中NF-κB p65蛋白水平明顯升高，細胞增殖活性明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，細胞中C-Caspase-3蛋白表達明顯增多，細胞分泌的IL-1β、IL-8、TNF-α明顯增多(均P<0.001)。見圖4、表2。

1,2：CSE+miR-212-5p組，CSE+miR-212-5p+PMA組

表2 NF-κB信號激活劑處理的轉染miR-212-5p mimics以后的CSE誘導條件下 MRC-5細胞增殖活性、凋亡率及C-Caspase-3、NF-κB p65蛋白水平和分泌的IL-1β、IL-8、TNF-α水平

3 討 論

肺成纖維細胞參與氣道重塑過程。在氣道重塑中，肺成纖維細胞產生大量的細胞因子如炎癥因子，增加肺組織炎癥反應，促進疾病進展〔11〕。CSE是肺成纖維細胞損傷的主要原因，CSE誘導肺成纖維細胞炎癥因子釋放、增殖抑制、細胞凋亡〔4〕。細胞釋放的炎癥因子一方面促進組織炎癥損傷，另一方面還可以激活細胞凋亡途徑，誘導細胞凋亡發生〔12〕。IL-1β、IL-8、TNF-α是常見的肺成纖維細胞分泌的炎癥因子，其表達水平越高，炎癥水平也就越高〔13〕。Caspase是與細胞凋亡有關的調控蛋白家族，其成員較多，在細胞凋亡中發揮促進作用〔14〕。Caspase蛋白成員在正常情況下以沒有活性的酶原形式存在于細胞內，只有被激活后才可以誘導細胞凋亡的發生〔15〕。Caspase-3是細胞凋亡的執行因子，也是Caspase凋亡反應的下游因子，其活化后是細胞凋亡發生的重要標志之一〔16〕。本研究結果說明，CSE誘導肺成纖維MRC-5細胞凋亡和炎癥因子釋放，成功構建了肺成纖維細胞體外損傷模型。

miRNA是一類沒有編碼蛋白質功能的小分子RNA，沒有開放閱讀框，長度大約為20 nt，miRNA在多種生命體內均有表達，并且其參與調控不同細胞生長、分化、能量代謝、衰老等過程〔17〕。miRNA還是一個與疾病進展有關的多功能調控因子，在不同的病理過程中的作用不同〔18〕。有研究表明，miRNA與慢性阻塞性肺疾病進展有關，在肺組織炎癥、細胞凋亡等過程中發揮關鍵功能〔19〕。miR-212-5p是一個多功能調控因子，廣泛參與正常生理和病理過程，如miR-212-5p具有保護神經細胞損傷的作用，miR-212-5p在癌癥進展中發揮抑制作用〔20，21〕。以前的研究發現，miR-212-5p參與成纖維細胞增殖調控，miR-212-5p在心肌梗死后心肌成纖維細胞中表達下調，并且miR-212-5p能夠抑制心肌成纖維細胞增殖〔9〕。在慢性阻塞性肺疾病患者中發現miR-212-5p表達下調，且上調miR-212-5p具有改善疾病損傷的功能〔10〕。本實驗顯示，CSE誘導的MRC-細胞中miR-212-5p表達下調，并且上調miR-212-5p抑制CSE誘導的MRC-5細胞增殖抑制，凋亡促進和炎癥因子分泌作用，miR-212-5p有改善CSE誘導的肺成纖維細胞炎癥因子表達和細胞凋亡作用，這與以前的研究結果〔10〕相符合，說明miR-212-5p可能是COPD保護因子。

NF-κB是一種從淋巴B細胞中發現的核轉錄因子，在幾乎所有的真核細胞中均有表達，NF-κB p65是NF-κB信號轉導的關鍵亞單位，其表達水平的高低與NF-κB信號激活水平相關〔22〕。NF-κB是機體炎癥反應的樞紐，與炎癥因子分泌關系十分密切。另外，NF-κB還與細胞凋亡、細胞生長、穩態維持等有關〔23〕。研究發現，NF-κB在COPD疾病小氣道重塑中發揮作用，NF-κB促進肺成纖維細胞分泌炎癥因子和細胞凋亡〔24〕。本研究結果提示，miR-212-5p作用機制與NF-κB有關。