長葉紅砂鈣依賴蛋白激酶RtCDPK16的非生物脅迫應答分析

張潔，程凱，王迎春

（省部共建草原家畜生殖調控與繁育國家重點實驗室，內蒙古自治區牧草與特色作物生物技術重點實驗室，內蒙古大學生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010040）

植物在生長發育過程中往往會遭遇干旱、水澇、高溫、冷害、高鹽等非生物脅迫，使其正常生長受到限制，甚至可能造成其死亡［1-2］。在長期適應過程中，植物逐漸形成了各種調控機制來應對不利的生存環境，鈣信號傳導系統就是其中之一［1，3］。當植物受到逆境刺激后，鈣離子結合蛋白能夠感知鈣信號并將其解碼，進而調節下游靶蛋白，引發一系列的胞內反應［1，4］。在高等植物中，有4類鈣離子結合蛋白，包括鈣調素（calmodulin，CaM）、鈣調素類蛋白（calmodulin-like protein，CML）、鈣依賴蛋白激酶（calmodulin-dependent protein kinases，CDPKs）及類鈣調磷酸酶B亞基蛋白（calcineurin B-like protein，CBL）［1，5-6］。其中，鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）是植物細胞中Ca2+的主要傳感器，在各種植物發育過程和適應非生物脅迫中發揮重要作用［7-10］。

CDPK也稱CPK，是Ser/Thr蛋白激酶，具有一個可變的N端結構域和3個功能結構域，包括一個蛋白激酶結構域、一個自身抑制結構域和一個鈣調蛋白結合結構域，通常含有4個EF-Hand［11-12］。CDPK在植物根、莖、葉、果實和種子中均有高度表達［11，13］。目前在不同物種的基因組中分別鑒定出大量CDPK基因，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）中34個、水稻（Oryza sativa）31個、玉米（Zea mays）25個和毛果楊（Populus trichocarpa）20個［6，11，14］。

逆境通常會改變植物細胞內Ca2+的含量，激活CDPKs的活性，從而調控植物體內離子穩態、抗氧化酶活性及逆境基因的表達［15］。對從不同的植物中克隆得到的CDPKs基因的功能研究表明，CDPKs在植物對非生物脅迫的響應中發揮了重要作用，過表達OsCPK12提高了水稻轉基因株系的抗氧化酶活性，減少了活性氧（reacitve oxygen species，ROS）的積累，增強了其耐鹽性［16-17］；過表達OsCPK13顯著提高了水稻轉基因株系的低溫抗性［18］；低溫會誘導玉米ZmCPK1高表達，同時抑制ZmCPK25的表達，提高其抗寒性［19］。玉米中過表達ZmCPK4能增加轉基因株系中滲透調節物質含量，提高抗旱性［20］。一些CDPKs還可以通過脫落酸（abscisic acid，ABA）信號途徑，作為非生物脅迫反應的正或負調控因子發揮作用［8，21］。脅迫條件下AtCPK3和AtCPK6正調控保衛細胞離子通道的開放和ABA依賴的氣孔信號傳導［22-23］。擬南芥CPK10突變體在ABA和Ca2+作用下表現出誘導氣孔關閉的特征，推測CPK10可能通過ABA信號途徑調節氣孔運動，進而提高擬南芥對干旱脅迫的耐受性［24］。相反，CPK21的功能喪失則使擬南芥幼苗對高滲脅迫具有更高的耐受性，突變株系在標記基因表達和代謝物積累方面均表現出增加的脅迫反應［25］。然而迄今為止，有關CDPKs的報道依然主要集中在擬南芥、水稻、小麥（Triticum aestivum）和玉米等模式作物及農作物中，針對其他野生抗逆植物中CDPKs的功能研究報道較少。

長葉紅砂（Reaumuria trigyna），檉柳科（Tamarieaceae）琵琶柴屬（Reaumuria），起源十分古老的珍稀泌鹽小灌木，限制性分布于我國西部東阿拉善-西鄂爾多斯地區，對惡劣的生存環境具有極強的適應性［11］。為了解析該植物的抗逆機制，本實驗室前期已對其進行轉錄組測序，并對RtNHX1、RtLDOX2、RtNAC100等基因功能開展研究，發現這些基因通過調控離子穩態、氧化平衡、滲透調節等途徑，在植物抵抗非生物脅迫中發揮重要作用［26-28］。然而，針對長葉紅砂的鈣傳感蛋白在其響應環境脅迫中的調控作用尚未開展研究。本研究對長葉紅砂轉錄組數據（編號：SRP008320）分析發現，鈣依賴蛋白激酶相關基因RtCDPK16在鹽脅迫下表達量較高，并對其進行了生物信息和表達特性分析；同時在擬南芥中超表達鑒定基因功能，為探討RtCDPK16作為鈣傳感蛋白參與植物逆境響應調控作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

長葉紅砂種子于2017年10月采集于內蒙古烏海市，充分干燥后在-20℃春化30 d。

1.2 RtCDPK16基因的克隆、表達特性分析及生物信息學分析

基于長葉紅砂轉錄組數據分析，基因Unigene430被注釋為鈣依賴蛋白激酶，與擬南芥的CDPK16基因相似度較高，其完整開放閱讀框（open reading frame，ORF）為1689 bp。設計特異性引物RtCPK16-F和RtCPK16-R，以長葉紅砂cDNA為模板，克隆完整ORF；利用在線軟件進行基因生物信息學分析；利用qRT-PCR檢測聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、NaCl、ABA、冷脅迫（cold stress，Cold）、CaCl2處理下長葉紅砂幼苗中的RtCDPK16基因的表達量，引物見表1。

1.3 RtCDPK16基因的亞細胞定位

亞細胞定位使用21 d煙草（Nicotiana tabacum）幼苗，載體為pPCAMBIA-1300和專一性的質膜Marker。共同培養目的載體和Marker后瞬時表達煙草，使用激光共聚焦觀察定位。

1.4 不同脅迫下過表達RtCDPK16擬南芥的抗逆性分析

1.4.1 不同脅迫下過表達RtCDPK16擬南芥的鑒定及生長指標測定 采用農桿菌花苞浸染法浸染擬南芥，T3代中挑選表達量相對較高的D1、D5和D6三個過表達（over expression，OE）株系。將OE株系和野生型（wild type，WT）種子播種于1/2 MS和125 mmol·L-1NaCl、300 mmol·L-1D-甘露醇（D-Mannitol）、3 μmol·L-1ABA培養基，一部分萌發10 d后用于觀察萌發率，一部分立體放置培養5 d后，再分別移至3種脅迫培養基豎直培養10 d觀察根長和側根數。種子萌發15 d后移至營養土中培養20 d，選取長勢一致的幼苗分別用200 mmol·L-1NaCl，100 μmol·L-1ABA水溶液脅迫處理幼苗14 d；停止澆水10 d檢測耐旱性，稱量鮮重及利用熒光法測定葉綠素含量［11］。

1.4.2 不同脅迫下過表達RtCDPK16擬南芥的生化指標測定 根據蘇州科銘試劑盒所帶說明書測定抗氧化酶SOD、POD、CAT、抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）、還原性谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（glutathione disulfide，GSSG）活性，H2O2、O2-及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量及滲透調節物質脯氨酸、可溶性糖和甜菜堿（betaine）含量。

1.4.3 不同脅迫下過表達RtCDPK16擬南芥葉片的DAB和NBT染色 剪不同脅迫處理下3片葉子，浸沒于1 mg·mL-1二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）和0.5 mg·mL-1氯化硝基四氮唑藍液（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）的工作液中，暗處理12 h后取出葉片用無水乙醇沖洗，并煮沸5 h脫去葉綠素，冷卻后制片，體視顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.4不同脅迫下過表達RtCDPK16擬南芥抗逆相關基因的表達量分析 提取不同脅迫處理下擬南芥RNA，反轉錄得到cDNA，基因定量分析，相關引物序列如表1。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primer sequences（5′-3′）

1.5 數據處理與分析

采用IBM SPSS Statistics 22進行數據顯著性分析，GraphPad Prism 7統計數據并繪圖，采用Duncan’s多重比較和Studentt檢驗進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 RtCDPK16基因氨基酸序列比對和進化分析

將RtCDPK16的氨基酸序列與其他物種進行同源比對發現，RtCDPK16蛋白與模式植物擬南芥AtCDPK16（A.thaliana，Q7XJR9.1）的同源性為78.46%，與葡萄VvCDPK16（Vitis vinifera，KF042356.1）的同源性最高，為80.97%。利用MEGA 6.0對長葉紅砂和擬南芥、葡萄（V.vinifera）以及山麻黃（Parasponia ersonii）等含有的CDPK序列構建了系統進化樹，發現RtCDPK16與菠菜（Spinacia oleracea）的親緣關系較近且聚為一類，與麥瓶草（Silene vulgaris）和藜（Chenopodium alblum）的親緣關系相對較遠（圖1）。

圖1 RtCDPK16基因氨基酸序列比對和進化分析Fig.1 Amino acid sequence alignment and evolution analysis of RtCDPK16

2.2 RtCDPK16基因的表達特性分析和亞細胞定位

qRT-PCR分析顯示，該基因在長葉紅砂根、莖、葉中均有表達，其中根的表達量最高，葉次之，莖最低（圖2）。同時，PEG、NaCl、ABA、cold以及高鈣脅迫處理，均能顯著誘導該基因的表達，干旱對其誘導作用最為強烈。激光共聚焦顯微鏡觀察RtCDPK16基因定位情況表明，空載GFP在煙草細胞所有部位表達，RtCDPK16-GFP融合蛋白的綠色熒光與質膜標記蛋白（ER marker cherry）的紅色熒光則均在細胞膜穩定表達；當兩者互相重合時，細胞膜呈現出黃色熒光，表明RtCDPK16在植物細胞中定位于細胞膜（圖2）。

圖2 RtCDPK16的表達特性與亞細胞定位分析Fig.2 RtCDPK16 specific expression and subcellular localization analysis

2.3 過表達RtCDPK16對擬南芥耐受非生物脅迫的影響

將pPZP221-RtCDPK16真核表達載體通過花序浸染法轉化至擬南芥（T0代）中。以T1擬南芥葉片基因組DNA為模板進行PCR擴增和電泳，發現轉基因株系D1～D6均在1700 bp處有明顯條帶，而野生型擬南芥（WT）無此條帶。將上述篩選得到的6個轉基因株系用含慶大霉素抗生素的培養基篩選至T3代，RT-PCR定量分析6個株系中RtCDPK16基因的表達情況，發現D1/D5/D6三個株系的表達量較高且能夠穩定遺傳，可用于后續研究（圖3）。

圖3 RtCDPK16轉基因擬南芥的鑒定Fig.3 Identification of RtCDPK16 transgenic A.thaliana

對過表達RtCDPK16擬南芥進行鹽、甘露醇、ABA脅迫處理，表型分析顯示3種脅迫下過表達株系比野生型具有更高的存活率，生長狀態明顯優于野生型。脅迫處理后，各株系的根系發育均受到明顯抑制，但過表達株系主根長及側根數均顯著高于野生型（圖4）。

圖4 不同脅迫對轉基因擬南芥幼苗存活率和根部發育的影響Fig.4 Effects of different stress on the survival rate and root development of transgenic Arabidopsis seedlings

為進一步確定RtCDPK16在擬南芥脅迫響應中所發揮的作用，對各株系進行土培實驗，發現在正常條件下，擬南芥的生長狀況無明顯差異；NaCl脅迫下，野生型植株相比轉基因株系葉片生長受限，蓮座葉較小，葉片萎蔫程度較大；甘露醇脅迫下，各株系均表現出葉片嚴重失水、萎蔫枯黃，但過表達株系與野生型相比所受影響較??；ABA處理下，過表達株系相比野生型葉片卷曲黃化程度較小，生長表型明顯優于野生型。NaCl、ABA、甘露醇處理下，擬南芥過表達株系的鮮重和葉綠素含量均明顯高于野生型（圖5）。

圖5 不同脅迫下擬南芥的生長表型及生理指標Fig.5 Growth phenotype，and physiological indicators of Arabidopsis under different stress

2.4 過表達RtCDPK16對轉基因擬南芥抗氧化能力的影響

為了進一步探討過表達RtCDPK16對轉基因擬南芥抗氧化能力的影響，檢測了NaCl、甘露醇和ABA脅迫處理下，擬南芥各株系的ROS積累和氧化損傷情況，結果顯示，3種脅迫下過表達株系的丙二醛（MDA）和電解質滲漏率（electrical leakage，EL）均顯著低于野生型。DAB和NBT染色結果顯示，正常條件下，野生型與過表達株系葉片無明顯的顏色差異，脅迫處理后，過表達株系相比野生型產生了較少的褐色和藍色物質，表明轉基因株系中積累的H2O2和O2-相比野生型較少；H2O2和O2-的含量檢測結果與染色分析結果一致，脅迫處理下，野生型的H2O2和O2-的積累速率和含量均顯著高于過表達株系（圖6和圖7）。

圖6 不同脅迫下的擬南芥葉片的DAB與NBT染色Fig.6 DAB and NBT staining of Arabidopsis leaves under different stress

圖7 不同脅迫下的擬南芥ROS的積累Fig.7 ROS accumulation of Arabidopsis under different stress

進一步檢測了鹽、甘露醇和ABA脅迫下，野生型和過表達株系中抗氧化酶SOD、POD、CAT的活性，AsA、GSH、GSSG及滲透調節物質脯氨酸、可溶性糖和甜菜堿的含量，結果顯示，脅迫處理顯著誘導各株系抗氧化酶活性以及抗氧化劑和滲透調節物質積累，過表達株系中SOD、POD、CAT酶活性，AsA、GSH以及脯氨酸、可溶性糖和甜菜堿的含量均顯著高于野生型，但GSSG含量顯著低于野生型（圖8）。表明過表達RtCDPK16顯著提升了脅迫處理下轉基因擬南芥的抗氧化和滲透調節能力。

圖8 不同脅迫下擬南芥的抗氧化酶活性和滲透調節物質含量Fig.8 Antioxidant enzyme activity and content of osmotic regulators of Arabidopsis under different stress

2.5 過表達RtCDPK16對擬南芥中脅迫相關基因表達量的影響

利用qRT-PCR檢測鹽、甘露醇和ABA脅迫下擬南芥中脅迫相關基因的表達量，結果表明，脅迫處理下抗氧 化 酶 相 關 基 因（AtSOD1、AtPOD1、AtCAT1、AtAPX1）、脅 迫 響 應 相 關 基 因（AtRD29A、AtDREB2A、AtRD22）、脯氨酸合成基因AtP5CS1以及ABA合成和信號通路關鍵元件基因（AtNCED3、AtABF4和AtSNRK2.2/2.3）均在過表達株系中被顯著誘導表達，表達量明顯高于野生型，表明過表達RtCDPK16促進了脅迫響應相關基因和ROS清除相關酶基因在轉錄水平的提高（圖9）。

圖9 不同脅迫下相關基因的表達量Fig.9 Expression of related genes under different stress

3 討論

3.1 過表達CDPKs對植物非生物脅迫的耐受性的影響

許多研究表明，CDPKs參與了植物對多種非生物脅迫的耐受調控。干旱、高鹽和低溫顯著誘導擬南芥中AtCDPK1和AtCDPK2的表達，同時過表達AtCDPK1能顯著提高轉基因株系的葉綠素含量和鮮重，緩解鹽脅迫帶來的生長抑制［29］。研究發現過表達唐古特白刺（Nitraria tangutorum）NtCDPK1可以顯著降低轉基因擬南芥的根長和側根數減少率，降低脅迫下葉片的黃化萎蔫程度，促進生物量和葉綠素的積累，從而提高其耐鹽耐旱及耐冷性［1］。在擬南芥中異源表達胡楊（Populus euphratica）PeCPK10基因可以顯著提高轉基因擬南芥的耐寒能力［30］；過表達葡萄的VaCPK20可以提高轉基因擬南芥在干旱和鹽脅迫下的存活率［31］。本研究從泌鹽鹽生植物長葉紅砂中克隆了RtCDPK16基因并將其在擬南芥中過表達，驗證其基因功能，結果證實，RtCDPK16提高了轉基因擬南芥幼苗在鹽、干旱及ABA脅迫下的存活率、根長和側根數、鮮重和葉綠素含量，表明過表達RtCDPK16可有效緩解轉基因株系因脅迫引起的生長抑制，增加其對脅迫的耐受性。

3.2 CDPKs對植物活性氧的積累和清除能力的影響

非生物脅迫誘導活性氧（ROS）的積累，而ROS作為一種有毒分子引起細胞的氧化損傷［32］。植物在抵抗非生物脅迫中已經進化出了防御系統，以盡量減少和防止ROS對細胞的氧化損傷，維持細胞的氧化還原穩態［33-34］。馬鈴薯（Solanum tuberosum）的CDPK4和CDPK5能通過磷酸化NADPH氧化酶來調節ROS的產生［35］，水稻OsCPK12的過表達降低了鹽脅迫條件下轉基因株系中H2O2含量，提高了水稻的耐鹽能力［36］。水稻OsCDPK4的超表達顯著降低了轉基因植物膜脂過氧化程度，提高細胞膜的完整性，從而提高水稻的耐鹽耐旱能力［37］，玉米ZmCPK4在擬南芥的過表達同樣能增加滲透調節物質的含量，保證細胞膜的完整性，進而提高轉基因擬南芥的抗旱性［20］。此外，CDPKs除抑制活性氧的產生，還可以通過提高抗氧化酶的活性，積極清除體內活性氧來應對脅迫。水稻中過表達OsCPK4/12/13均可以顯著提高轉基因植株的SOD/POD/CAT/抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）等相關抗氧化酶活性，增加脯氨酸和可溶性糖的含量，從而降低MDA含量，積累更少的ROS，提高水稻的低溫抗性［36-38］。也有研究發現，CDPKs有時也作為負調控因子起作用［39］。例如突變擬南芥的CPK21，能顯著提高其抗氧化酶活性及脯氨酸含量，降低電導率，表現出比野生型更強的耐旱性［25］。本研究發現，在擬南芥中過表達長葉紅砂RtCDPK16顯著降低了擬南芥的膜損傷程度，緩解了電解質滲漏，使轉基因植物積累較少的H2O2和O2-，顯著提高了脅迫條件下轉基因擬南芥的抗氧化酶SOD、POD、CAT活性，增加了抗氧化劑AsA、GSH和滲透調節物質脯氨酸、可溶性糖和甜菜堿的含量，從而提高了轉基因株系的抗氧化和滲透調節能力，降低了細胞膜的氧化損傷程度和電解質滲透率。同時發現轉基因株系的抗氧化酶基因AtSOD1、AtPOD1、AtAPX1、AtCAT1，脯氨酸合成關鍵基因AtP5CS1在脅迫條件下被顯著誘導表達，過表達RtCDPK16在轉錄水平上調控了抗氧化酶基因和滲透調節物質基因的高表達，從而促進了酶活性的升高和脯氨酸/可溶性糖含量的增加，使轉基因植物比野生型具有更高的氧化和滲透平衡調節能力。

3.3 CDPKs參與調控ABA信號的分子機制對抗逆性的影響

CDPKs通過參與ABA信號轉導，介導植物對非生物脅迫的耐受性［40］。有報道稱擬南芥CDPKs通過磷酸化ABA響應元件結合因子（ABFs）參與ABA信號通路，如擬南芥CPK4和CPK11參與了ABA調控的生理過程，包括種子萌發、幼苗生長、氣孔運動和對鹽脅迫的耐受性。CPK4和CPK11可以磷酸化兩個ABA響應轉錄因子ABF1和ABF4，表明它們在CDPK介導的ABA信號通路中是正調控因子［41］。擬南芥CPK32與ABF4相互作用，并在體外可以磷酸化ABF4，表明CPK32可以通過磷酸化ABF4調控ABA應答基因的表達，進而參與ABA信號通路對脅迫的應答［42］。此外，擬南芥的CPK10突變體在ABA和Ca2+作用下表現出氣孔關閉誘導和氣孔開放抑制受損［24］。本研究發現脅迫條件下轉基因擬南芥中ABA合成及信號通路相關基因AtABF4、AtSNRK2.2/2.3和AtNCED3的表達量均顯著高于野生型，推測RtCDPK16的超表達可能促進植物ABA信號的轉導，通過ABA信號通路調節下游相關脅迫應答反應。

4 結論

1）RtCDPK16的過表達有利于轉基因擬南芥氧化平衡的維持，減輕脅迫引起的氧化損傷，提高了抗氧化酶活性，緩解了脅迫帶來的ROS積累，增加了滲透調節物質的積累，促進了轉基因植物的抗逆性。

2）RtCDPK16作為一個正調控因子在植物抗逆過程中發揮作用。

3）RtCDPK16可能促進ABA參與植物對脅迫的應答，通過ABA信號通路調節應對相關非生物脅迫。