艱難梭菌感染的分子診斷標志物及治療的研究進展

黃 俊,吳夏楠,曹 炬

(1.重慶醫科大學附屬第一醫院醫學檢驗科,重慶 400016;2.空軍軍醫大學唐都醫院檢驗科,陜西 西安 710038)

艱難梭菌(clostridioides difficile, CD),最初被命名為艱難芽孢桿菌(bacillus difficile),是一種革蘭氏陽性、有鞭毛且專性厭氧的芽孢桿菌[1]。CD主要以孢子的形式通過糞-口途徑傳播,廣泛分布于人和動物的腸道以及環境中。CD存活能力強,其芽孢可在自然環境中存活數月,普通消毒劑很難將其殺滅[2]。雖然這種細菌已確定為健康新生兒正常腸道菌群中的一部分,但Hall等[1]指出這種生物能夠在動物中引起疾病,可能是通過產生可溶性外毒素所導致的。近年來,抗生素、免疫抑制劑、激素類藥物和放化療藥物等使用日益增加及高毒力菌株ST-1(BI/NIP1/027)的暴發流行,艱難梭菌感染(clostridioides difficile infection, CDI)的發病率和嚴重程度在全球范圍內一直呈上升趨勢,目前已是院內感染性腹瀉和抗生素相關性腹瀉的主要病原菌之一[3～8]。因此,艱難梭菌感染的診斷和治療面臨著巨大挑戰,本文對CDI的診斷相關生物標志物和治療的研究進展進行綜述,為臨床工作者們提供診療思路。

1 艱難梭菌的致病機制

在正常情況下,人體腸道中的微生物菌群維持著良好的穩態平衡。然而,在長期或不規范使用廣譜抗生素、免疫抑制劑、激素和放化療藥物以及高齡因素的影響下,腸道定植能力減弱,腸道菌紊亂,CD大量繁殖同時釋放毒素破壞腸黏膜細胞并損傷腸壁,從而引起以發熱、腹痛、腹瀉為主要臨床癥狀的艱難梭菌相關性腹瀉(clostridium difficile associated diarrhea,CDAD),其臨床表現可從輕度的自限性腹瀉到嚴重的偽膜性腸炎,甚至中毒性巨結腸,繼而誘發腸穿孔、腹腔感染、敗血癥等[6, 9]。

1.1 Tcd A和Tcd B在大多數CD菌株中,致病性位點通常編碼五種蛋白質,定位于染色體的特定位置[10]。由致病性位點編碼的主要毒素是TcdA(也稱為ToxA)和TcdB(也稱為ToxB),這是兩種分泌性蛋白[11, 12]。毒素與宿主細胞表面特定的受體形成復合物被細胞內吞,核內體的酸化使毒素蛋白肽鏈C端可結合的重復寡肽序列(CROPs)結構域嵌入核內體膜,并隨后將半胱氨酸蛋白酶結構域(CPD)和葡萄糖轉移酶結構域(GTD)運輸到細胞質中。肌醇六磷酸(IP6)激活半胱氨酸蛋白酶裂解并釋放具有毒性的糖轉移酶。GTD發揮催化作用使RHO或RAC GTPase家族糖基化,GTP結合蛋白失活,上皮細胞肌動蛋白發生解聚,細胞骨架損壞,最終導致腸上皮緊密連接和上皮完整性的破壞[10, 13, 14]。多項研究表明[15～20],雖然TcdA和TcdB在大多數感染中都起一定作用,但TcdB在疾病的嚴重程度方面可能更重要。

1.2 Tcd R、Tcd C和Tcd E致病基因位點還編碼另外三種蛋白質,TcdR、TcdC和TcdE[13]。在艱難梭菌穩定生長時, TcdR驅動TcdA和TcdB的轉錄,促進TcdA和TcdB的蛋白表達[21]。在指數生長期間,艱難梭菌表達更高水平的TcdC,從而抑制TcdA和TcdB的轉錄,但艱難梭菌的超毒力與TcdC序列的缺失有關[22, 23]。TcdE編碼一種膽堿樣蛋白,有助于缺乏常規分泌信號序列的TcdA和TcdB的分泌[13]。最近的研究表明,在分泌大量毒素的艱難梭菌菌株中,TcdE參與了TcdA和TcdB的分泌[24]。

1.3 二元毒素(CDT)某些CD菌株,尤其是高毒力菌株ST-1(BI/NIP1/027)可以產生第三種毒素,稱為艱難梭菌轉移酶或者二元毒素 (Binary toxin,CDT),其可能增強CD菌株的毒力[13]。盡管CDT的存在與患者較高的死亡率之間存在關聯,但CDT在毒力中的作用尚未得到證實[7]。CDT由CdtA和CdtB兩種蛋白質組成,CdtB亞基與細胞受體(LSR)結合,酸化的核內體上形成孔,CdtA亞基被釋放到細胞質中[25～27]。CdtA的ADP核糖基轉移酶活化后可抑制細胞膜附近的肌動蛋白聚合[13]。目前有研究表明[28～30],在小鼠感染模型中CDT還可以通過抑制宿主保護性的嗜酸性粒細胞反應或促進細菌的粘附和定植來增強艱難梭菌的毒性。

1.4 其他毒力因素鞭毛能控制細菌運動和粘附,對艱難梭菌的定殖效率和毒力極為重要,腸上皮粘附受損與鞭毛有關,同時也有研究表明鞭毛蛋白的表達和毒素調節之間存在聯系[31～34]。此外,有粘附力的纖連結合蛋白A,細胞壁蛋白如Cwp66, S層蛋白A及其修飾蛋白酶Cwp84,甚至Spo0A(產孢的主要調節因子)都有助于艱難梭菌粘附,并在生物膜形成中發揮作用[35～37]。

2 CDI的分子診斷相關標志物

2.1 毒素發生CDI時,機體結腸炎癥損傷主要是CD產毒株釋放的毒素所引起的。同時有研究表明,CDI所導致的疾病嚴重程度與機體內的CD毒素水平密切有關。因此,TcdA和TcdB常作為臨床輔助診斷艱難梭菌感染的生物標志物,檢測體內是否存在毒素及其水平尤為重要。目前毒素的檢測可通過細胞毒性中和試驗、產毒株素培養、毒素免疫檢測、艱難梭菌毒素基因檢測等方法。毒素的檢測在CDI臨床診斷中特異性高,細胞毒性中和試驗被認為是CDI實驗室診斷的參考方法。

2.2 谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase, GDH)GDH是一種高度保守的代謝酶,其屬于抗原性酶蛋白,在所有艱難梭菌表面表達高且穩定性好,常用酶免疫法直接檢測糞便中的GDH[38]。GDH檢測成本低,簡單快速且敏感度高,可作為常規檢測CDI的診斷工具之一[39]。因所有艱難梭菌菌株都能表達高水平的GDH,所以檢測GDH不能區分產毒和非產毒株[40]。GDH陽性僅表明存在艱難梭菌,GDH檢測陰性則可排除艱難梭菌感染[41]。因此,GDH可作為糞便標本中艱難梭菌存在的相關生物標志物,但其不作為快速診斷CDI的首選方法[9]。

2.3 乳鐵蛋白和鈣衛蛋白乳鐵蛋白和鈣衛蛋白主要是來自中性粒細胞的兩種蛋白質,由胃腸道在感染和粘膜炎癥反應時釋放,可被常規用于監測腸道疾病患者的炎癥水平[42]。艱難梭菌感染發生后,宿主的腸組織學特征為中性粒細胞浸潤,糞便乳鐵蛋白或鈣衛蛋白可能是診斷疾病活動程度的潛在生物標志物[41]。一些研究顯示,CDI患者的乳鐵蛋白和鈣衛蛋白水平高于CD檢測陰性的腹瀉患者和非腹瀉對照組[43～45]。然而,糞便中乳鐵蛋白和鈣衛蛋白水平存在巨大變異性,CDI患者與對照組之間存在重疊[46, 47]。這兩種檢測的敏感度和特異度低,因此,不推薦將這兩種蛋白用于常規篩查。

2.4 免疫細胞因子發生CDI后,機體啟動的固有免疫和適應性免疫應答在疾病的發展及嚴重程度中至關重要[48, 49]。宿主對CDI的急性反應是由毒素介導炎癥損傷及大量炎癥因子的釋放引起的。研究發現,糞便或者血清中細胞因子或趨化因子的水平與艱難梭菌感染的嚴重程度有關,從而可作為艱難梭菌感染時的輔助診斷及預后的生物標志物[50, 51]。

3 CDI的治療

3.1 抗菌治療在臨床上可提供非達霉素和萬古霉素的情況下,不再推薦甲硝唑作為CDI的一線治療藥物[52, 53]。非達霉素是治療首次發生CDI及復發的首選藥物。對于暴發性CDI通常采用大劑量口服萬古霉素、靜脈注射甲硝唑、直腸萬古霉素(對腸梗阻患者)和早期外科會診[53]。

3.2 抗毒素治療除常規使用抗生素外,貝洛托舒單抗(Bezlotoxumab)是治療CDI復發兩次及以上的首選藥物。Bezlotoxumab是全人源的單克隆抗體,靶向艱難梭菌的毒素B,可以阻斷毒素與宿主細胞結合的能力。對于復發風險較高的患者,一次性靜脈注射Bezlotoxumab可作為復發預防策略[54]。研究顯示,刀豆素 A 、川楝素、腐敗菌素和抗瘧藥米帕林等藥物可抑制核內體酸化;天然黃酮類化合物根皮素能非競爭性直接抑制毒素 GTD 的活性;化合物依布硒可共價結合半胱氨酸殘基阻斷毒素B的自催化過程,以上多個小分子抑制劑可用于阻斷毒素作用,從而在不同程度抑制 TcdB 對細胞的毒害作用[55～57]。

3.3 糞便菌群移植(fecal microbiota transplanta-tion, FMT)與益生菌治療FMT是將健康人糞便中的微生物菌群移植到患者腸道內,為CDI患者恢復正常的腸道菌群。目前,FMT僅適用于反復感染艱難梭菌的患者。一項隨機對照試驗研究顯示,FMT對治療復發性艱難梭菌感染明顯比使用萬古霉素更有效[58]。由于目前的檢測手段無法明確糞便的完整成分,FMT可能會帶來一些并發癥。益生菌可調節腸道菌群,抑制有害菌種在腸道內過度繁殖。研究表明,益生菌在治療原發性CDI方面有良好的作用,但其使用劑量和種類及治療時間對CDI的治療效果有很大的影響,因此,目前不建議使用益生菌治療作為常規治療手段[4]。

3.4 光動力治療(Photodynamic therapy,PDT)PDT是一種有前景的殺滅細菌的替代方法[59]。抗微生物PDT 方法基于PDT概念,涉及一種稱為光敏劑的光活性染料,該染料靶向微生物細胞,能夠在光照射下產生由單線態氧和/或自由基組成的活性氧,以根除細菌以及真菌、病毒和原生動物[60]。

4 總結

目前,CDI的診斷和治療仍充滿了挑戰?？焖?、準確地診斷CDI對于指導臨床治療和預防醫院內CD傳播至關重要?？咕幬镏委熓荂DI的首選治療方式,但也是發生CDI的重要危險因素,應根據CDI患者臨床表現,綜合多種治療手段。因此,深入研究特異度好和靈敏度高的分子診斷生物標志物,開發針對CD的靶向治療,為臨床CDI治療提供新的策略仍然是目前亟待解決的科學問題。