煙草煙霧暴露的人支氣管上皮細胞鐵死亡情況觀察及其機制

賀紅霞，周金玲，金明

湖北民族大學附屬荊門市第一人民醫院呼吸與危重癥醫學科，湖北荊門 448000

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種以持續氣流受限為特征的常見肺部疾病，煙草煙霧暴露是COPD發病危險因素之一［1］。煙草煙霧中含有大量活性氧（ROS）［2］，ROS導致的氧化應激紊亂是COPD主要發病機制之一［3］。支氣管上皮細胞（BEC）作為呼吸道的重要保護屏障，受到吸煙過程中釋放的大量ROS和氧化產物攻擊，導致細胞內氧化/抗氧化失衡，直接造成BEC損傷，在COPD發病機制中起重要作用［4］。同時，煙草煙霧暴露增加了BEC發生多種調節性細胞死亡（RCD）的風險，相關研究顯示，長期煙霧暴露可誘發BEC發生凋亡、壞死等多種RCD［5-6］。鐵死亡是一種新定義的RCD，不同于傳統的凋亡和壞死，鐵死亡是一種以游離二價鐵超載與磷脂過氧化介導Fenton反應共同參與的新型RCD［7］。鐵穩態的破壞會導致機體氧化應激和組織損傷，誘發鐵死亡，其已被發現參與調控炎性腸病［8］、心肌病［9］等多系統疾病的發生發展。既往研究顯示，在吸煙者的肺組織中發現了包括鐵在內的多種顆粒物質過量沉積［10］。基于此，我們提出科學假設：煙草煙霧暴露可能通過誘導細胞鐵超載和氧化還原紊亂，觸發BEC鐵死亡，從而參與COPD發生發展。2021年1月—2022年6月，本研究圍繞上述假設進行實驗，探討煙草煙霧暴露對體外培養的人BEC鐵死亡的影響及其作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料 正常人BEC（BEAS-2B）購自中科院上海細胞庫。細胞爬片、6孔板、12孔板和96孔板購自中國耐思，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、0.2 μm過濾器購自美國Millipore。0.25%胰酶、DMEM高糖培養基和胎牛血清購自美國Gibco-BRL，還原型谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒購自美國Sigma，蛋白酶抑制劑購自美國Roche Diagnostics，DAPI染色液、RI和ROS探針購自美國Invitrogen，4%多聚甲醛溶液、抗體稀釋液、免疫染色封閉液、抗熒光淬滅封片劑、RIPA裂解液購自上海碧云天，HRP標記的FITC標記山羊抗兔Alexa Fluor 488?（A-11034）、FITC標記山羊抗鼠 Alexa Fluor 594?（A-11032）熒光二抗、磷酸酶抑制劑（Cocktail 100×）、Western blotting洗脫液和蛋白marker購自美國Thermo Fisher Scientific，EdU試劑盒購自中國銳博，鐵死亡抑制劑（Fer-1）、凋亡抑制劑（Z-VAD-FMK）、細胞壞死抑制劑（Nec-1）購自美國Selleck，CCK-8試劑盒購自日本Dojindo，逆轉錄試劑盒、SYBR?Green實時熒光定量PCR預混液購自中國大連寶生，鐵離子檢測試劑購自美國Abcam，鐵死亡相關因子谷胱甘肽過氧化酶4（GPx4）、鐵蛋白重鏈1（FTH1）及環加氧酶2（Ptgs2）一抗購自美國Abcam。二氧化碳培養箱購自日本SANYO，熒光倒置顯微鏡購自德國Leica，普通PCR擴增儀購自美國Labnet，qPCR儀、mini垂直電泳系統、蛋白快速轉膜儀、凝膠成像系統購自美國Bio-Rad，分光光度儀購自美國BioTek-Epoch2，FACSAria流式細胞儀購自美國BD Biosciences，透射電鏡購自日本JEOL。

1.2 細胞培養 使用含10%胎牛血清、200 U/mL青霉素及200 U/mL鏈霉素的完全DMEM高糖培養基培養人支氣管上皮細胞BEAS-2B，每2～3 d更換培養基，待細胞融合度述80%～90%時，棄掉培養基，滅菌PBS清洗1次，吸凈PBS，加入0.25%胰酶1 mL，37 ℃培養箱消化1～2 min，將細胞移至顯微鏡下觀察其形態變化，如細胞出現收縮、變圓或移動時，棄掉胰酶，加入2 mL完全培養基吹打，使細胞團分散、懸浮，傳代培養；待細胞穩定傳代3代后，取對數生長期的BEAS-2B細胞用于實驗。

1.3 煙草煙霧提取物（CSE）培養基制備 某品牌香煙，每只煙含焦油13 mg、一氧化碳17 mg、尼古丁1.2 mg。參考WIRTZ等［11］CSE制備方法進行操作：點燃香煙，去濾嘴，安放于抽吸裝置上，使煙霧通過10 mL無血清DMEM培養基，每支香煙燃燒2 min。當10支香煙產生的煙霧通過該培養基后停止抽吸，經0.22 μm過濾器過濾后即為CSE培養基。分光光度儀于320 nm波長下測定光密度（OD）值，定義此OD值的CSE培養基濃度為100%，根據后續實驗需要將CSE稀釋至所需濃度。

1.4 不同濃度CSE對BEAS-2B細胞鐵死亡的影響觀察

1.4.1 細胞分組與處理 取對數生長期的BEAS-2B細胞培養24 h后，分為對照組、0.5% CSE組、1.0%CSE組及2.0% CSE組，分別使用不同濃度的CSE（0、0.5%、1.0%和2.0%）處理24 h，用于后續實驗。

1.4.2 細胞增殖活性觀察 ①細胞增殖能力：采用EdU染色。取不同濃度CSE處理后的各組細胞，參照EdU試劑盒操作說明書進行抗熒光淬滅劑封片后，熒光顯微鏡下觀察并拍照，EdU陽性細胞數越多說明細胞增殖能力越強。②細胞活性：采用CCK-8法。取不同濃度CSE處理后的各組細胞，按3 000/孔的接種到96孔板，將混有CCK-8試劑的培養基（CCK-8試劑∶培養基按1∶10充分混合）加入每個孔，37 ℃孵育2 h，分光光度儀在450 nm波長下讀取各孔OD值，每組設置6個復孔。

1.4.3 細胞Fe2+水平檢測 采用比色法。取不同濃度CSE處理后的各組細胞，預冷PBS清洗1次，加入鐵離子分析緩沖液裂解細胞，裂解產物中加入鐵還原抑制劑減少Fe3+向Fe2+轉換，混合均勻后室溫反應30 min。加入Fe2+檢測探針充分混合，60 ℃條件下反應30 min。分光光度儀在593 nm波長下讀取OD值。

1.4.4 細胞氧化還原情況觀察 ①細胞ROS水平：采用流式細胞術。取不同濃度CSE處理后的各組細胞，加入ROS熒光探針（1∶2 000），37 ℃避光孵育30 min。收集細胞于15 ml離心管，PBS離心洗滌1次，500 μL PBS重懸，40 μm細胞過濾器過濾細胞懸液，流式細胞儀檢測各組細胞熒光ROS強度，Flowjo流式軟件分析數據。②細胞GSH水平：采用比色法。取不同濃度CSE處理后的各組細胞，用含1 mmol/L EDTA的50 mmol/L MES緩沖液均質化。4 ℃、10 000 γ/min離心10 min，上清液分別與GSH檢測工作液和標準品混合，室溫下反應25 min。使用分光光度儀在412 nm波長下讀取OD值，每組設置3個復孔。

1.4.5 細胞鐵死亡相關因子FTH1、Ptgs2、GPx4 mRNA及蛋白觀察 ①mRNA：采用q-PCR法。取不同濃度CSE處理后的各組細胞，TRIzol法提取細胞總RNA，逆轉錄生成cDNA，使用q-PCR定量分析結果。引物序列：FTH1上游為5'-ATCTGGCTTGGCGGAATAT-3'，下游為 5'-TCAAAGACAACACCTGGGTA-3'；Ptgs2 上 游 為 5'-TCAAGTCCCTGAGCATCTAC-3'，下游為 5'-CATTCCTACCACCAGCAACC-3'；GPx4上游為5'-GAGGCAAGACCGAAGTAAACTAC-3'，下游為 5'-CCGAACTGGTTACACGGGAA-3'；內參β-actin上游為5'-GAGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3'，下游為 5'-CGATGCCGTGCTCGATGGGG-3'。循環條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共 40個循環。以 β-actin為內參，按 2-ΔΔCt法計算FTH1、Ptgs2、GPx4 mRNA相對表達量。②蛋白：采用Western blotting法。取不同濃度CSE處理后的各組細胞，棄掉培養基，用4 ℃預冷處理的PBS清洗細胞，向6孔板每孔加入預冷的RIPA裂解液200 μL置于冰上裂解細胞獲取細胞總蛋白。BCA法測定所獲樣本蛋白濃度，加入Western blotting 5×蛋白上樣緩沖液，充分混勻，接著加入上述混合物5%體積的β-巰基乙醇，充分混合后的蛋白樣品置于金屬加熱器，100 ℃、5 min使蛋白樣品充分變性。所的樣品依次經SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、牛奶封閉，加入Ptgs2、FTH1、GPx4一抗（1∶2 000）4 ℃搖床孵育過夜；次日TBST洗膜，加入HRP標記的二抗（1∶4 000）室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜；ECL發光液滴加到膜條帶上，用Bio-Rad凝膠成像系統顯影，Image J圖像分析軟件統計分析結果，β-actin作為等量蛋白上樣對照。

1.4.6 細胞死亡情況觀察 采用碘化丙啶染色。取不同濃度CSE處理后的各組細胞爬片，加入碘化丙啶染色工作液，室溫避光染色5 min，PBS清洗爬片細胞（注意避光），抗熒光淬滅劑封片后，熒光顯微鏡觀察、拍照，觀察細胞死亡情況。

1.4.7 細胞線粒體結構觀察 采用透射電鏡。收集對照組、2.0% CSE組細胞于2 mL離心管，PBS離心洗滌1次，棄掉培養基，加入4 ℃預冷的戊二醛溶液400 μL，室溫放置1 h后轉至4 ℃，次日通過透射電鏡觀察細胞線粒體結構。

1.5 鐵死亡抑制劑Fer-1對CSE誘導BEAS-2B細胞鐵死亡的影響觀察

1.5.1 細胞處理 取對數生長期的BEAS-2B細胞培養24 h，分為Fer-1組、Nec-1組、Z-VAD-FMK組及CSE組，分別給予鐵死亡抑制劑Fer-1、壞死抑制劑Nec-1、凋亡抑制劑Z-VAD-FMK及不加試劑預處理2 h后，加入2.0% CSE培養基處理24 h，用于后續實驗。

1.5.2 Fer-1對CSE誘導BEAS-2B細胞活性的影響觀察 取各組細胞，采用CCK-8法觀察細胞活性，方法同“1.4.2”。

1.5.3 Fer-1對CSE誘導BEAS-2B細胞Fe2+水平及氧化還原的影響觀察 取Fer-1組、CSE組細胞，比色法檢測細胞Fe2+水平，方法同“1.4.3”；采用流式細胞術檢測細胞ROS水平，ELISA法檢測細胞GSH水平，方法同“1.4.4”。

1.5.4 Fer-1對CSE誘導BEAS-2B細胞FTH1、Ptgs2、GPx4 mRNA及蛋白的影響觀察 取Fer-1組、CSE組細胞，采用q-PCR法檢測細胞FTH1、Ptgs2、GPx4 mRNA，采用Western blotting法檢測細胞FTH1、Ptgs2、GPx4蛋白，方法同“1.4.5”。

1.5.5 Fer-1對CSE誘導BEAS-2B細胞死亡的影響觀察 取Fer-1組、CSE組細胞，采用碘化丙啶染色觀察細胞死亡情況，方法同“1.4.6”。

1.6 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。計量資料采用Shapiro-Wilk法進行正態性檢驗，符合正態分布且方差齊性的資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度CSE對BEAS-2B細胞增殖活性的影響 對照組、0.5% CSE組、1.0% CSE組、2.0% CSE組 EdU 陽性細胞數分別為（10.600 ± 0.548）、（5.810 ± 0.837）、（3.011 ± 0.707）、（1.026 ±0.447）個，OD 值分別為 1.117 ± 0.034、0.797 ±0.062、0.532 ± 0.027、0.220 ± 0.030，EdU 陽性細胞數、OD值對照組＞0.5% CSE組＞1.0% CSE組＞2.0% CSE組（P均＜0.05）。

2.2 不同濃度CSE對BEAS-2B細胞Fe2+水平的影響 對照組、0.5% CSE組、1.0% CSE組、2.0% CSE組細胞 Fe2+水平分別為 0.225 ± 0.047、0.602 ±0.043、1.176 ± 0.124、2.101 ± 0.163，細胞 Fe2+水平對照組＜0.5% CSE組＜1.0% CSE組＜2.0% CSE組（P均＜0.05）。

2.3 不同濃度CSE對BEAS-2B細胞氧化還原的影響 對照組、0.5% CSE組、1.0% CSE組、2.0% CSE組細胞 ROS 水平分別為 1.013 ± 0.041、2.077 ±0.044、2.912 ± 0.027、4.381 ± 0.045，GSH水平分別為 1.154 ± 0.089、0.821 ± 0.065、0.581 ± 0.050、0.328 ± 0.042，細胞ROS水平對照組＜0.5% CSE組＜1.0% CSE組＜2.0% CSE組，GSH水平對照組＞0.5%CSE組＞1.0% CSE組＞2.0% CSE組（P均＜0.05）。

2.4 不同濃度CSE對BEAS-2B細胞FTH1、Ptgs2、GPx4 mRNA及蛋白的影響 見表1。

表1 不同濃度CSE對BEAS-2B細胞FTH1、Ptgs2、GPx4mRNA及蛋白的影響（-x ± s）

2.5 不同濃度CSE對BEAS-2B細胞死亡的影響碘化丙啶染色顯示，對照組、0.5% CSE組、1.0%CSE組、2.0% CSE組陽性細胞數分別為（1.500 ±0.577）、（10.750 ± 0.957）、（16.510 ± 1.291）、（33.250 ± 2.062）個，陽性細胞數對照組＜0.5% CSE組＜1.0% CSE組＜2.0% CSE組（P均＜0.05）。

2.6 CSE對BEAS-2B細胞線粒體結構的影響 透射電鏡結果顯示，BEAS-2B細胞經2.0% CSE處理后出現線粒體萎縮變小，線粒體雙層膜密度增高，線粒體脊減少甚至消失等典型鐵死亡線粒體超微結構改變。見OSID碼圖1。

2.7 Fer-1對CSE誘導BEAS-2B細胞鐵死亡的影響

2.7.1 Fer-1對CSE誘導BEAS-2B細胞活性的影響 Fer-1組、Nec-1組、Z-VAD-FMK組、CSE組OD值分別為 0.596 ± 0.029、0.372 ± 0.018、0.371 ±0.007、0.364 ± 0.041，OD 值 Fer-1組＞Nec-1組、ZVAD-FMK組、CSE組（P均＜0.05），Nec-1組、Z-VADFMK組、CSE組OD值比較差異無統計學意義。

2.7.2 Fer-1對CSE誘導BEAS-2B細胞Fe2+水平及氧化還原的影響 見表2。

表2 Fer-1對CSE誘導BEAS-2B細胞Fe2+、ROS、GSH水平的影響（±s）

表2 Fer-1對CSE誘導BEAS-2B細胞Fe2+、ROS、GSH水平的影響（±s）

注：與CSE組比較，*P＜0.05。

組別CSE組Fer-1組Fe2+1.980 ± 0.080 0.699 ± 0.067*ROS 2.834 ± 0.015 1.977 ± 0.017*GSH 0.342 ± 0.084 0.612 ± 0.072*

2.7.3 Fer-1對CSE誘導BEAS-2B細胞FTH1、Ptgs2、GPx4 mRNA及蛋白的影響 見表3。

表3 Fer-1對CSE誘導BEAS-2B細胞FTH1、Ptgs2、GPx4 mRNA及蛋白表達的影響（-x ± s）

2.7.4 Fer-1對CSE誘導BEAS-2B細胞死亡的影響 碘化丙啶染色顯示，CSE組、Fer-1組陽性細胞數分別為（35.500 ± 1.291）、（23.750 ± 0.957）個，陽性細胞數Fer-1組低于CSE組（P＜0.05）。

3 討論

COPD是一個重要的全球公共衛生問題，吸煙是COPD的主要危險因素之一［12］，長期慢性煙霧暴露所致的炎癥因子異常反應被認為是COPD發病機制中重要的一部分［1-2］。煙草煙霧暴露導致氣道慢性炎癥、黏液生成增加、肺組織破壞和小氣道改造，這些病理生理過程在很大程度上導致氣道氣流阻塞，推動COPD的持續進展［13］。

鐵死亡是一種新發現的以鐵依賴性脂質過氧化為特征的RCD方式，細胞線粒體縮小、線粒體脊斷裂及無染色質凝集等鐵死亡特征性線粒體超微結構改變使其區別于壞死、凋亡等RCD［7］。鐵死亡已被發現涉及多種疾病的發生發展，如參與調控炎性腸病［8］、心肌病［9］等疾病，而其是否參與調控COPD的發生發展過程則不是十分明確。

BEC是呼吸道抵御吸入性環境損傷的第一道防線，也是許多呼吸道病毒的攻擊目標［4］。既往研究顯示，煙草煙霧會損害人原代小氣道上皮細胞Toll樣受體3（TLR3）的裂解，導致抗病毒藥物功效受損［14］。而煙草煙霧是如何影響BEC功能的，仍不完全清楚。作為呼吸道重要的保護屏障，BEC在內、外源性氧化應激狀態下可分泌GSH等多種抗氧化物質以適應短時期的氧化損傷狀態［15］。煙草煙霧中含有大量的ROS，長期煙草煙霧暴露可通過ROS介導氧化應激反應造成細胞損傷，導致支氣管上皮細胞氧化/抗氧化失衡，造成肺實質和氣道壁的不可逆損傷［2］。

鐵作為一種微量元素，參與了機體許多重要的生理過程，如線體粒呼吸、DNA合成、細胞分裂和血紅蛋白合成等［16］。鐵蛋白是由鐵蛋白輕鏈（FTL）和重鏈（FTH1）兩個亞基以不同比例組合而成的蛋白復合物，是細胞內鐵儲存的主要蛋白。FTH1作為鐵蛋白的亞基之一，具有亞鐵氧化酶活性，是結合鐵所必需的。細胞FTH1基因缺失導致細胞儲鐵能力下降，增加了細胞鐵池游離鐵水平，顯著提高了細胞鐵死亡的敏感性［17］；反之，鐵蛋白表達增加（如在多種腫瘤細胞中）能提高細胞對氧化應激的抗性，降低細胞鐵死亡，從而促進腫瘤細胞的生長［18］。因此，鐵穩態的維持對機體生理生化過程至關重要，而細胞內鐵的異常累積將會誘發細胞鐵死亡。CHEN等［19］研究顯示，青蒿素化合物能夠通過調節IRP-IRE軸上調細胞內游離鐵水平，誘發腫瘤細胞鐵死亡。LIU等［20］發現，轉錄調控因子Nupr1可通過介導脂質運載蛋白2（LCN2）表達上調，減少細胞內鐵積累，從而減緩鐵死亡發生。

既往研究顯示，ROS介導的鐵蛋白降解過度能夠通過釋放鐵離子，觸發細胞Fenton反應和脂質過氧化，誘導細胞鐵死亡［7］。本研究結果顯示，BEAS-2B細胞抗氧化指標GSH水平隨著CSE濃度增高而下調；與之相反，CSE呈濃度依賴性的上調BEAS-2B細胞ROS及Fe2+水平。q-PCR及Western blotting可見隨著CSE濃度增高，BEAS-2B細胞GPx4、FTH1 mRNA及蛋白表達降低，Ptgs2 mRNA及蛋白表達升高。同時，CSE暴露誘導的BEAS-2B細胞出現典型的鐵死亡線粒體超微結構改變。而鐵死亡抑制劑Fer-1能有效逆轉BEAS-2B細胞活性下降，降低細胞內Fe2+、ROS水平，增高GSH水平，并使GPx4、FTH1 mRNA及蛋白表達回升，Ptgs2 mRNA及蛋白表達降低。結合上述結果我們分析，CSE暴露觸發BEAS-2B細胞鐵死亡可能與其誘導細胞鐵蛋白FTH1降解過度，釋放鐵離子以及GSH等氧化還原物質急劇消耗引起BEAS-2B細胞氧化還原紊亂有關。

綜上所述，CSE能夠通過上調BEAS-2B細胞內Fe2+水平、加快GSH耗竭，觸發細胞內氧化還原紊亂，從而誘導BEAS-2B細胞鐵死亡。BEC的凋亡和壞死性死亡已被證實在COPD發病機制中發揮著重要作用［5-6］，但在我們的研究中，除鐵死亡抑制劑Fer-1外，無論是壞死抑制劑Nec-1還是凋亡抑制劑ZVAD-FMK均未顯示出對CSE誘導的BEAS-2B細胞死亡有明顯的抑制作用。導致這種差異的原因可能為不同劑量CSE在不同時間節點上所觸發的RCD類型不同，因此很難明確究竟是哪一種RCD占據CSE調控BEAS-2B細胞死亡的主導地位。但我們的研究仍然表明，在目前CSE誘導BEAS-2B細胞死亡的研究中，至少部分歸因于CSE誘導BEAS-2B細胞鐵超載和氧化還原紊亂觸發其鐵死亡。