miR-210-5p對膿毒癥小鼠心肌損傷的調控作用及其分子機制

2023-03-03 07:11:06劉治國李煒董文婷張曉東

山東醫藥 2023年5期

關鍵詞：小鼠

劉治國，李煒，董文婷，張曉東

西安國際醫學中心醫院心臟內科，西安 710100

膿毒癥是一種嚴重危及生命的疾病，定義為系統性感染并伴有急性器官功能障礙，多器官功能障礙綜合征（MODS）被認為是膿毒癥的終末狀態［1］。盡管MODS根據受影響的器官不同而呈現不同的臨床癥狀，但當伴有心血管并發癥時，患者死亡風險可達70%～90%［2］。膿毒癥誘發的心肌病是一種可逆性心肌功能障礙，其病理機制是由炎癥細胞因子、線粒體功能障礙、局部缺血、內皮素、心肌抑制劑物質上調和抗凝系統激活而造成的心肌損傷［3］。微小RNA（miRNA）是一組小的非編碼RNA，通過促進信使RNA（mRNA）降解或阻斷mRNA翻譯來負調控基因表達。許多miRNA被認為是某些疾病診斷或治療的生物標志物和可能靶點。研究顯示，miR-210的表達在急性心肌梗死、動脈粥樣硬化、主動脈狹窄和心力衰竭等心血管疾病中發生改變［4］，且miR-210過表達對這些疾病的靶器官具有保護作用［5］。另有研究發現，miR-210-5p過表達可緩解高氯化鈉飲食大鼠心臟的纖維化進展［6］。然而，miR-210-5p在膿毒癥心肌損傷中的作用及機制尚未見報道。2022年4月—9月，本研究通過盲腸結扎穿孔術建立膿毒癥小鼠模型，觀察miR-210-5p在膿毒癥心肌損傷中的作用并探討其機制，旨在為膿毒癥所致心肌損傷的治療提供新的靶點及方向。

1 材料與方法

1.1 主要材料清潔級雄性C57BL/6小鼠40只，8周齡，體質量22～25 g，購自空軍軍醫大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（軍）2007-007號。肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌鈣蛋白I（cTnI）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；超氧化物陰離子熒光探針（DHE）購自美國Invitrogen公司；TUNEL檢測試劑盒購自瑞士Roche公司；過氧化物酶（MPO）、剪切半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase-3）、沉默調節蛋白 1（SIRT1）、叉頭框蛋白 O1（FOXO1）、乙酰化 FOXO1（Ac-FOXO1）、核因子κB亞基 p65（NF-κB p65）、乙酰化 NF-κB p65（Ac-NF-κB p65）及GAPDH抗體均購自美國Abcam公司，羊抗兔、羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋公司，miR-210-5p、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）、白細胞介素 1β（IL-1β）、IL-6、單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）及內參U6、GAPDH引物均由上海生工生物工程有限公司構建。

1.2 動物建模及分組處理將40只C57BL/6小鼠隨機分為對照組、膿毒癥組、膿毒癥+miR-210-5p激動劑組、膿毒癥+miR-210-5p拮抗劑組，每組10只。除對照組外均采用盲腸結扎穿孔術建立小鼠膿毒癥模型［7］。操作步驟：小鼠用2%的異氟烷麻醉后腹部脫毛，在腹部皮膚組織中線垂直切口2～3 cm，打開腹膜進入腹腔。將位于腹部左側的盲腸小心拉出，并將糞便內容物擠向盲袋。距盲腸末端1 cm用絲線結扎回盲瓣遠端盲腸組織，使用18號針，在盲腸上進行兩次穿透性穿刺。為了確認穿刺針穿刺成功，在還納腹腔之前，將少量糞便從盲腸通過穿刺孔暴露出來。使用6.0絲線縫合腹膜及皮膚，然后腹腔注射預熱生理鹽水（0.05 mL/g）進行復蘇。對照組小鼠采用不結扎、不穿刺的剖腹手術進行對照。膿毒癥+miR-210-5p激動劑組、膿毒癥+miR-210-5p拮抗劑組小鼠在建模前1 d及建模術后即刻分別經尾靜脈注射10 nmol/L的miR-210-5p激動劑agomir及miR-210-5p拮抗劑antagomir，對照組和膿毒癥組在相同時間經尾靜脈注射等體積生理鹽水。

1.3 miR-210-5p對膿毒癥小鼠心功能的調控作用觀察采用超聲心動圖。小鼠經2%異氟烷麻醉后，剔除胸前毛發，置于恒溫操作臺。使用Vevo770超聲心動圖系統經胸超聲心動圖評價小鼠左心室功能的變化，在長軸和短軸視圖下分別獲得二維和M模式圖像。對每只小鼠采集3個獨立心動周期的圖像，測量左心室射血分數（LVEF）和左心室縮短分數（LVFS），以此評價左心室收縮功能。

1.4 miR-210-5p對膿毒癥小鼠心肌損傷的調控作用觀察

1.4.1 心肌組織病理改變采用HE染色。各組心功能檢查后處死，取出心臟，采集部分心臟樣本，在4%的多聚甲醛中固定過夜，脫水，石蠟包埋，切成5 μm的切片。脫蠟后，心肌組織切片在分級乙醇溶液中復水，用蘇木精和伊紅染色，光鏡下觀察心肌組織病理改變。

1.4.2 血清心肌損傷標志物CK-MB、cTnI 采用比色法。各組小鼠處死后，頸動脈留取1 mL血樣，靜置離心后獲得上層血清，采用比色法嚴格按照試劑盒說明書測定小鼠血清CK-MB、cTnI水平。

1.5 miR-210-5p對膿毒癥小鼠心肌組織細胞凋亡的調控作用觀察

1.5.1 細胞凋亡率采用TUNEL染色。將“1.4.1”制備好的心臟石蠟脫蠟并在分級乙醇溶液中復水，使用TUNEL凋亡檢測試劑盒對細胞進行染色分析。通過末端脫氧核苷基轉移酶dUTP切口末端標記反應檢測到凋亡細胞顯示為綠色，通過DAPI染液染色所有細胞的細胞核顯示為藍色，使用激光共聚焦顯微鏡觀察并獲取圖像。凋亡率以凋亡細胞數（綠色）/計數細胞總數（藍色）×100%表示。

1.5.2 凋亡蛋白cleaved Caspase-3 采用Western blotting法。取各組心臟組織，用裂解緩沖液提取蛋白質，用BCA法測定總蛋白濃度。用SDS-PAGE分離蛋白質并轉移到PVDF膜上。分別加入cleaved Caspase-3及GAPDH（1∶1 000）一抗孵育膜過夜，用山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）二抗孵育膜。使用Bio-Rad成像系統檢測條帶，以GAPDH為內參對蛋白進行半定量分析，以目的條帶與對照條帶灰度比值作為目的蛋白相對表達量。

1.6 miR-210-5p對膿毒癥小鼠心肌組織炎癥反應的調控作用觀察

1.6.1 中性粒細胞浸潤采用免疫組化染色將“1.4.1”制備好的心臟石蠟脫蠟并在梯度級乙醇溶液中復水，用3% H2O2在室溫下作用10 min，抑制內源性過氧化物酶活性。切片用5%山羊血清阻斷30 min，使用抗MPO一抗（1∶200）在4 ℃下孵育過夜。洗滌后繼續將切片與山羊抗兔IgG二抗在37 ℃孵育30 min。干燥后，用中性膠固定切片，在顯微鏡下觀察中心粒細胞浸潤情況，以MPO免疫組化染色相對表達強度反映心肌組織中性粒細胞浸潤程度。

1.6.2 炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1 采用實時熒光定量PCR法。各組心功能檢查后處死，取出心臟，采集部分心肌組織樣本，TRIzol試劑提取心肌組織樣本中總RNA，根據PrimeScript?RT Master Mix的說明書，使用隨機引物從RNA中反轉錄提取cDNA，所有cDNA在使用前保存在-80 ℃。引物序列：TNF-α正向引物5'-ACTCCAGGCGGTGCCTATG-3'，反向引物 5'-GTGAGGGTCTGGGCCATAGAA-3'；IL-1β正向引物5'-TGATGTGCTGCTGCGAGATT-3'，反向引物 5'-TGCCACCTTTTGA-CAGTGATG-3'；IL-6 正向引物 5'-TGATGGATGCTACCAAACTGGA-3'，反向引物 5'-TGTGACTCCAGCTTATCTCTTGG-3'；MCP-1 正向引物 5'-TAAAAACCTGGATCGGAACCAAA-3'，反向引物 5'-GCATTAGCTTCAGATTTACGGGT-3'；GAPDH 正向引物5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'，反向引物5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACTC-3'。反應條件：94 ℃、5 min，94 ℃、10 s，60 ℃、20 s，72 ℃、30 s，重復擴增40個循環。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1相對表達量。

1.7 miR-210-5p對膿毒癥小鼠心肌組織氧化應激水平的調控作用觀察

1.7.1 抗氧化物SOD、GSH、GSH-Px 采用比色法。取各組小鼠左室心肌組織10 mg，充分研磨后均質于測定緩沖液中，嚴格按照試劑盒說明書測定心肌組織中抗氧化物SOD、GSH和GSH-Px表達。

1.7.2 過氧化物MDA 采用比色法。方法同“1.7.1”，嚴格按照試劑盒說明書測定心肌組織過氧化物MDA表達。

1.7.3 活性氧（ROS）生成采用DHE染色。取小鼠左心室心臟標本經液氮速凍后切成10 μm厚的冰凍切片，滴加DHE染液反應30 min，使用激光共聚焦顯微鏡觀察并獲取圖像，用Image J軟件分析結果，以DHE熒光強度表示心肌組織ROS生成情況。

1.8 miR-210-5p對膿毒癥小鼠心肌組織SIRT1通路相關蛋白的調控作用觀察

1.8.1 SIRT1蛋白采用Western blotting法。取各組小鼠心臟組織，轉膜后加入SIRT1、GAPDH一抗（1∶1 000），其余操作方法同“1.5.2”。以GAPDH為內參，以目的條帶與對照條帶灰度比值作為目的蛋白相對表達量。

1.8.2 FOXO1、NF-κB p65乙酰化程度采用Western blotting法。取各組小鼠心臟組織，轉膜后加入FOXO1、Ac-FOXO1、NF-κB p65、Ac-NF-κB p65及 GAPDH 一抗（1∶1 000），其余操作方法同“1.5.2”。以GAPDH為內參，以目的條帶與對照條帶灰度比值作為目的蛋白相對表達量，以Ac-FOXO1/FOXO1、Ac-NF-κB p65/NF-κB p65 反映FOXO1、NF-κB p65乙酰化程度。

1.9 統計學方法采用GraphPad Prism統計軟件。計量資料通過Sample K-S進行正態檢驗，符合正態分布的以±s表示，組間比較行t檢驗，多組間比較行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。