基于多重連接探針擴增技術的食品中六重過敏原成分檢測

王鳴秋，劉 艷，李詩瑤，董婉婷，張 濤，林 津，朱必婷，張 莉,*

（1.湖北省食品質量安全監督檢驗研究院 動物源性食品中重點化學危害物檢測技術國家市場監管重點實驗室，湖北省食品質量安全檢測工程技術研究中心，湖北 武漢 430075；2.武漢軟件工程職業學院，湖北 武漢 430205）

食品過敏被世界衛生組織納入5 個最重要的公共健康問題之一。據統計，在西方工業化國家高達10%的人群受其影響[1]，中國人群橫斷面調查顯示自述/父母報告食物過敏發病率為4.8%～21.13%[2]。過敏癥患者攝入過敏原可引發多種免疫反應，包括蕁麻疹、瘙癢、水腫、支氣管痙攣、鼻炎、嘔吐腹瀉，甚至呼吸困難、過敏性休克等致命癥狀[3-5]。一般情況下，過敏原的暴露量為1～100 mg/kg時會引發過敏反應，但有時微量攝入也可致敏。

目前，針對食物過敏尚無有效的治療手段，唯一可行的辦法是避免食入可能導致過敏的食物成分，而消費者預防過敏的途徑就是通過食品標簽明示信息選擇不含過敏原的食物[6]。因此，實施過敏原標簽管理是避免食物過敏的重要手段之一。據聯合國糧食及農業組織和世界衛生組織統計，90%以上的食物過敏反應由麩質、甲殼類、魚、雞蛋、花生、大豆、牛乳和樹堅果類八大類過敏原引起[7]。在此基礎上，國際法典委員會、歐盟、美國、日韓、澳大利亞等各國根據本地區過敏原流行病學分析制定了各國食品過敏原清單并出臺法規條例進行標識管理[8-10]。我國在GB/T 23779—2011《預包裝食品中的致敏原成分》和GB 7718—2009《預包裝食品標簽通則》等標準中對八大類過敏原的種類和標簽標識也作出了明確規定[11-12]，但在標識風險評估方面仍處于初步研究階段。因此，開發能夠監測和識別食品中常見過敏原的靈敏可靠的分析方法，無論對于過敏原評估、標簽管理和風險控制都至關重要。

對于種類復雜且高度加工的食品，一方面其配料本身含有過敏原成分，另一方面存在微量的無意帶入，這導致同一食品中可能同時存在多種過敏原成分，且某些過敏原含量甚微[13]。傳統檢測過敏原的方法多基于免疫學分析，但蛋白質容易受加工條件和復雜基質影響難以滿足食品中微量過敏原成分的檢測[14]。而DNA分子在工業加工食品中表現出比蛋白質更高的穩定性，且不會被食品基質掩蓋，因而在過敏原檢測中能夠發揮獨特分析優勢[15-17]。近年來在食品檢測領域應用廣泛的實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）技術能夠通過在一次反應中設置多個靶標實現過敏原的多重檢測[18-19]。但多重real-time PCR體系存在一些不可忽視的缺陷，包括靶標擴增的偏好性，不同引物間的自我抑制等[20]。

多重連接探針擴增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）技術是近年來發展起來的一種針對待檢DNA序列進行多重定性和半定量分析的新技術，可以通過單一引物進行多達20～50 重靶標的擴增，并通過添加雜交探針靈活擴展檢測體系的容量，實現比PCR更高的多重水平，具備高特異性和再現性[21]。目前，MLPA技術已成功應用于人類疾病分子診斷[22]、食品藥品真實性鑒定[23]、食源性致病菌檢測[24]等領域的研究。

本研究開發一種基于MLPA技術的多重檢測體系，成功用于不同食品中常見的6 種過敏原成分（大豆、芝麻、核桃、杏仁、榛子、花生）的同時篩查，具備高效、靈活、特異的優勢，旨在為生產企業過敏原污染控制和食品過敏原監管提供技術支撐，保護消費者的食品安全和生命健康。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6 種過敏原材料（大豆、芝麻、核桃、杏仁、榛子、花生）、特異性驗證材料（小麥、大麥、燕麥、青椒、大米、玉米、南瓜、土豆、紅豆、芒果、橙、桃、杏、牛、豬、沙蝦、黑魚）、自制模擬樣本材料（小麥粉、黃油、糖粉）及商品化食品樣品均購于大型商超，特異性驗證材料大腸埃希氏菌標準菌株ATCC 25922來自本實驗室儲藏菌株。

DNeasy?meicon Food Kit 德國Qiagen公司；Premix ExTaq（Probe qPCR） 大連寶生物公司；SALSA MLPA EK5 reagent kit 荷蘭MRC-Holland公司；MLPA探針由武漢擎科合成；毛細管電泳緩沖液、POP-7膠、GeneScan 500 LIZ 美國ABI公司。

1.2 儀器與設備

3500毛細管基因分析儀 美國ABI公司；T200 PCR擴增儀、CFX-96熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司；Tissue LyserII組織研磨儀、QIAxpert核酸濃度測定儀 德國Qiagen公司；5424R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；A11 basic研磨儀 德國IKA公司；GM 300均質器 德國Retsch GmbH公司。

1.3 方法

1.3.1 模擬參考樣本的制備

將6 種過敏原材料用研磨儀磨碎，并過篩（20 目）成細粉末待用。制備面團140 g（70 g小麥粉、56 g黃油、14 g糖粉）；稱取粉末各10 g與面團混合，均質15 min直至混合均勻。180 ℃烘焙20 min，制成5%的模擬餅干。同時制備不加過敏原的面團相同處理制成0%模擬餅干。將過敏原含量為5%與0%模擬餅干磨碎，以不同質量比混合，均質15 min，分別制成過敏原含量為10000、1000、100、10、5、1、0.1 mg/kg的模擬餅干參考樣品。

1.3.2 DNA提取

液體樣品取40 mL于離心管中12000 r/min離心15 min，取沉淀作為DNA提取起始樣本；固體樣品直接稱取2 g樣本，按照試劑盒說明書進行基因組DNA提取。使用QIAxpert測定DNA含量和評估DNA純度。提取后的DNA稀釋至20 ng/μL存放于-20 ℃備用。

1.3.3 MLPA探針的設計與合成

NCBI獲取大豆、芝麻、核桃、杏仁、榛子、花生6 種源性成分的內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）序列作為探針設計靶標，根據MRCHolland公司提供的探針設計要點，使用Geneious 10.2.2設計對應MLPA探針對，BLAST驗證其特異性。探針采用高效液相色譜純化，右側探針5’端采用磷酸化處理。PCR擴增引物采用試劑盒自帶引物。左探針（left probe oligonucleotide，LPO）和右探針（right probe oligonucleotide，RPO）及引物序列見表1。

表1 MLPA檢測探針及引物序列Table 1 Probes and primers used for MLPA

1.3.4 MLPA檢測

參照MLPA試劑盒說明書進行MLPA檢測：取5 μL DNA模板（20 ng/μL）95 ℃變性5 min，冷卻至25 ℃，加入3 μL雜交混合液（1.5 μL探針混合液和1.5 μL SALSA緩沖液），60 ℃雜交16 h。探針混合液中各探針終含量為2 fmol。加入連接酶反應液32 μL（3 μL緩沖液A、3 μL緩沖液B、25 μL H2O、1 μL Ligase-65），54 ℃、15 min，98 ℃、5 min。冷卻至25 ℃后加入PCR反應混合液10 μL（7.5 μL H2O，2 μL PCR primer mix，0.5 μL SALSA聚合酶），95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環35 次，72 ℃、20 min。每個反應設置2 個平行。

取1 μL PCR產物（稀釋10～100 倍），加入9 μL HiDi和0.5 μL Genescan 500 LIZ混合，用3500毛細管基因分析儀進行毛細管電泳片段分析。電泳條件為運行溫度60 ℃、進樣時間5 s、進樣電壓1.6 kV、運行時間1800 s、運行電壓15 kV。數據由GeneMapper 4.0軟件進行分析。

1.3.5 PCR產物測序

將6 種過敏原單重檢測中PCR產物純化送至武漢擎科生物有限公司進行雙向測序，測序結果經Geneious 10.2.2軟件拼接后在NCBI GenBank進行BLAST比對驗證。

2 結果與分析

2.1 檢測靶標的選擇和探針的設計

ITS是核糖體基因18S-5.8S-26S之間內部轉錄間隔序列，核糖體編碼基因在植物中高度保守，但ITS具有物種特異性，能夠區分親緣性較高的物種，是植物系統發育學最受關注的工具之一[25]。同時，由于ITS序列的多拷貝特性，更適合經過復雜加工的食品樣品的DNA擴增，能夠提高檢測的靈敏度[26]。因此，本研究選取核糖體DNA ITS區域作為靶標序列設計大豆、芝麻、核桃、杏仁、榛子和花生6 種過敏原探針。

MLPA檢測每個靶標需要設計兩個相鄰的半探針LPO和RPO，包含各自特異性雜交位點（hybridizing site，HS）以及通用引物結合位點（primer binding site，PBS）。為便于片段分析，每個靶標LPO和RPO連接片段長度應相差4 bp以上，本研究在PBS和HS間加入了填充序列調整產物長度以區分不同靶標。當相鄰的半探針與目標結合并連接后，會產生特定大小的目標DNA產物，經通用引物PCR擴增后即可由毛細管電泳分離檢測。

2.2 特異性分析

探針序列在NCBI GenBank中經BLAST比對驗證，顯示6 對探針特異性良好。每種探針與其靶標物種DNA模板進行MLPA測試，均產生單一擴增峰，其大小分別為芝麻103.16 bp、榛子110.98 bp、大豆115.67 bp、花生119.61 bp、核桃123.75 bp、杏仁130.78 bp，結果見圖1。將PCR產物測序序列經BLAST比對確證為對應物種ITS序列，同源性均為100%。利用6 種探針組合進行隨機多重檢測，均可產生與預期大小一致的擴增峰，這說明該MLPA體系能夠進行六重過敏原的同時檢測。混合探針實際片段大小與理論值有2 bp左右偏差，其原因可能為1）Genescan 500LIZ與待測片段熒光標記不同導致的電泳遷移率不同；2）不同片段DNA結構和堿基組成的不同導致遷移率不同[27]。

圖1 6 種過敏原混合MLPA毛細管電泳檢測圖Fig.1 Capillary electrophoresis of the MLPA system using a mixture of sesame,hazelnut,soybean,peanut,walnut and almond DNAs

鑒于食品成分的復雜性，有必要將含過敏原食品中可能出現的物種作為特異性篩查對象進行驗證。結果表明（表2），除杏仁外，其他探針與待測物種均無交叉反應。而杏仁探針與杏、桃均有交叉反應，這與其物種親緣關系較近有關，這提示當食品中同時含有杏仁與這幾種成分時陽性結果需通過測序或其他技術手段進一步區分。

表2 過敏原MLPA體系特異性驗證結果Table 2 Specificity of allergen-MLPA system

2.3 靈敏度分析結果

由于缺乏多重過敏原成分檢測的標準樣品，課題組自制模擬參考樣品測定MLPA體系的靈敏度?？紤]到大豆、芝麻、核桃、杏仁、榛子和花生以配料形式廣泛存在于各類食品中，本研究選取了餅干作為模擬樣品制備的基質，同時添加6 種過敏原，其中各過敏原含量0.1～10000 mg/kg不等，充分模擬了食品加工過程中過敏原的無意污染和有意添加的情況。所有原材料均預先進行了MLPA測定，證實不含有靶標物質。

該方法靈敏度定義為在該含量下，所有平行實驗均為陽性結果。圖2顯示了模擬參考樣品在過敏原含量為100、10、5、1 mg/kg時MLPA毛細管電泳測定圖譜，可見隨著過敏原含量逐漸降低，擴增峰信號值也隨之降低，直至含量為1 mg/kg時平行實驗結果部分為陰性。因此，經測定本方法總靈敏度為5 mg/kg。6 種過敏原中，核桃信號峰較其他成分始終較低，含量為5 mg/kg時信號值已降至接近1000 RFU，而在各模板濃度相同的混合樣本測定時并非如此（圖1），推測與該成分DNA提取效率較低有關。起始材料取樣量相同的情況下進行DNA提取時，其他5 種過敏原材料最終提取質量濃度可達50～100 ng/μL之間，而核桃質量濃度只有20 ng/μL左右。主信號峰左側（n-1）處出現的低信號峰與進樣速度和寡核苷酸雜質有關。為避免導致嚴重過敏反應，理想的過敏原檢出限應為1～100 mg/kg過敏原成分或1～10 mg/kg蛋白組分[28]，而本方法達到的檢出限5 mg/kg能夠滿足該要求，且低于López-Calleja[20]、Mustorp[29]以及García-García[30]等報道的10～50 mg/kg的檢出限。與現有過敏原標準SN/T 1961—2013《出口食品過敏原成分檢測》[31]對比，利用單重real-time PCR檢測大豆、杏仁、芝麻、核桃、榛子時其檢出限為100 mg/kg，遠高于本方法檢出限。

圖2 添加6 種過敏原模擬樣品MLPA毛細管電泳檢測圖Fig.2 Capillary electrophoresis patterns for MLPA analysis of model cookie spiked with six allergens at different concentrations

2.4 實際樣品分析結果

為評估過敏原MLPA體系對于實際樣本的檢測能力，對市售30 份食品樣品進行過敏原MLPA測定，包括糖果、巧克力、調味醬、麥片、冰淇淋、糕點、飲料、嬰幼兒輔食等。根據各國過敏原標識規定，商品的過敏原標簽應包括強制標識含有的過敏原成分及交叉接觸導致可能含有的過敏原標識。本研究采集的30 份樣品中，通過標識“該產品含有××”、“可能含有××”或“該生產線同時生產××”等提示添加或可能含有的過敏原成分。表3顯示了各樣品過敏原標識情況及最終檢測結果，圖3顯示了典型樣品的MLPA檢測結果。

表3 市售食品過敏原MLPA檢測結果Table 3 Results of MLPA analysis of commercial food products

圖3 實際樣品MLPA毛細管電泳檢測圖Fig.3 Capillary electrophoresis patterns for MLPA analysis of commercial food products

從表3可見，50%的樣品檢測結果與過敏原標稱不一致（樣品3、4、5、9、10、13、15、18、19、22、23、24、25、29、30），其中樣品3、4、5、9、13、22、23、25、29、30檢出未標稱的過敏原成分，而樣品3、10、15、18、19、24部分標稱過敏原未檢出。這可能是由于同一生產線生產不同產品中途未清洗徹底或原料儲存時的交叉污染導致，也有部分結果可能是以低價原料冒充高價原料的故意摻假行為所致。但無論是何種原因，這種與標稱過敏原不一致的情況很可能會導致過敏人群的誤食行為，帶來安全隱患。

由于微量過敏成分便有可能引發過敏反應，市售商品一般會在食品包裝上以“可能含有”字樣進行免責申明。以上檢測結果中，樣品4、5、9、23、25所檢出的與聲稱不一致的成分均在可能含有提示中出現，從一定程度上能夠提醒消費者避免食用風險。然而，大部分可能含有的提示成分也并未在最終檢出結果中呈現，這也提示在過敏原標簽管理上應該更加嚴格和謹慎，避免因為過度標注而提升過敏癥人群選購食品的難度。

3 結論

與其他過敏原檢測方法相比，MLPA檢測具備以下優勢：探針標記簡單、用量少、成本低；探針之間相互影響小，能夠在體系中靈活添加或減少，多重檢測靶標數量多等。但食品中過敏原核酸檢測受限于食品基質和加工的影響，對方法的檢出限和抗抑制能力要求較高。本研究建立的六重過敏原MLPA檢測體系能夠同時對芝麻、花生、大豆、杏仁、榛子和核桃進行檢測，檢出限為5 mg/kg，特異性較好、靈敏度高，性能滿足市售樣品檢測需求，有望成為過敏原標簽監管的有力技術支撐。而杏仁源性探針的特異性有待進一步提升，以區分親緣關系較近物種。