先天性干擾素免疫缺陷致遺傳性分枝桿菌易感綜合征的機制研究

涂小嬌 劉亭亭 劉 紅 張福仁

山東第一醫科大學附屬皮膚病醫院(山東省皮膚病醫院),山東省皮膚病性病防治研究所,濟南,250022

γ-干擾素(interferon-γ, IFN-γ)主要由自然殺傷細胞(natural killer cells, NK細胞)和活化的T細胞(Th1以及CD8+T細胞)產生,作為驅動免疫防御的關鍵角色,在先天性和適應性免疫中都發揮著重要作用。鑒于其在免疫系統中的重要功能,IFN-γ免疫缺陷可以導致許多疾病的發生,如遺傳性分枝桿菌易感綜合征(mendelian susceptibility to mycobacterial disease, MSMD)［1］。MSMD是一種罕見的遺傳性疾病,患者易對卡介苗(BCG Vaccine)和環境分枝桿菌等弱毒力分枝桿菌選擇性易感。本文回顧了目前已發現的MSMD患者致病突變及介導的IFN-γ免疫缺陷,這些MSMD患者大多是幼年發病,一般表現為播散性分枝桿菌感染,少數患者有鳥分枝桿菌感染或伴有其他細菌感染,大多數在接種BCG之后發病,可出現長時間發熱并伴有強烈的急性期反應,如體重減輕、肝脾腫大、骨損傷等,患者接種BCG部位周圍淋巴結可出現腫大伴壓痛,淋巴結活檢能檢測到抗酸桿菌,使用抗分枝桿菌治療有效,急性期患者由于病情較重可能出現生命危險。同時在所有已知的原發性免疫缺陷或先天性免疫異常中,MSMD表現出最高水平的遺傳異質性［2］。自1996年以來,已經報道了18個與MSMD相關的致病基因:IFNG、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL23R、ISG15、TYK2、RORC、IFNGR1、STAT1、CYBB、IFNGR2、JAK1、IRF8、SPPL2A、NEMO、TBX21、ZNFX1。其中IL12RB1和IFNGR1基因突變是MSMD最常見的遺傳病因,在目前發現的遺傳缺陷病例中約占80%［3］。MSMD相關的基因突變包含多種遺傳模式,如常染色體隱性遺傳(autosomal recessive, AR)、常染色體顯性遺傳(autosomal dominant, AD)或X連鎖隱性遺傳(X-linked recessive, XR)［4-6］。同一基因不同突變也可以表現為不同遺傳類型。基因突變會影響其編碼的蛋白表達,從而影響其介導的功能［7,8］。雖然致病基因和突變類型存在異質性,但這些遺傳變異均可造成先天性IFN-γ免疫缺陷。根據其對IFN-γ介導的免疫功能的影響將這些致病基因分為三種類型:直接引發IFN-γ表達下降的基因如IFNG、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL23R、ISG15、TYK2、RORC;減緩IFN-γ介導的免疫反應的基因如IFNGR1、IFNGR2、JAK1、STAT1、CYBB;同時下調IFN-γ表達及反應的基因如IRF8、SPPL2A、NEMO、TBX21［7,8］。此外近期有研究發現與MSMD相關的新的致病基因ZNFX1,其突變對IFN-γ相關免疫反應及其抗菌免疫機制的影響仍需進一步探索。

1 MSMD的致病基因

1.1 影響IFN-γ表達的基因 基因如IFNG、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL23R、ISG15、TYK2、RORC發生突變后,可直接引發IFN-γ表達下降從而使機體防御弱毒力分枝桿菌能力下降,導致弱毒力分枝桿菌易感。

IFNG基因編碼IFN-γ蛋白,Kerner等發現2例MSMD患者攜帶IFNG純合突變c.354_357del(p.T119Ifs*4)。研究發現突變會使HEK293T細胞、皰疹病毒感染的患者T細胞(HVS-T細胞)IFN-γ表達缺失,同時患者CD4+、CD8+和γδT細胞分泌的IFN-γ減少［7］。

IL12B基因編碼IL-12p40,IL-12p40和IL-12p35共同組成IL-12p70［9,10］,在誘導NK和T淋巴細胞產生IFN-γ中起主要作用［10,11］。Alodayani等［12］發現3例來自沙特阿拉伯的MSMD患者攜帶IL12B純合突變 c.G180del(p. W60*)。實驗室發現該突變會抑制患者外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)IL-12p40產生;同時在BCG、IFN-γ刺激下患者PBMC分泌的IL-12p70也減少。此外,多項研究報道了IL12B突變類型存在一定的地域性,如沙特阿拉伯的患者攜帶 315_316insA/315_316insA［12］,印度/巴基斯坦的患者多攜帶g.482+83_856-855del,伊朗患者是 c.527_528del,突尼斯患者則是c.298_305del。這些突變均使患者全血細胞分泌的IL-12p40減少,從而導致IFN-γ分泌減少［13］。

IL12RB1基因編碼IL-12Rβ1,其與IL-12Rβ2組成IL-12受體復合物。IL-12與IL-12受體復合物結合激活JAK-STAT信號通路促進IFN-γ分泌［14-16］。自1998年起,研究發現了多種與MSMD相關的IL12RB1突變,IL-12Rβ1表達異常使IFN-γ分泌下降是MSMD最常見的遺傳病因［14,17-19］。例如,Altare等發現4例MSMD患者在IL12RB1基因發生三種純合突變,分別為c.913A>T、c.783+1G>C、c.641A>G。這4例患者都患有播散性分枝桿菌感染,其中兩例還有非典型傷寒沙門氏菌感染。在PHA刺激下患者外周血T細胞和HVS-T細胞的細胞表面IL-12Rβ1表達缺失;在Mtb或PHA刺激下,患者T細胞IFN-γ分泌下降［18］。

IL-12Rβ2由IL12RB2基因編碼,是組成IL-12受體的另一個亞基［16］。Martínez等發現有BCG疫苗接種史的MSMD患者IL12RB2基因發生純合突變 c.412C>T(p.Q138*)。在IL-12刺激下患者B淋巴細胞系STAT4磷酸化降低,HVS-T細胞、HEK293T細胞的IL-12Rβ2表達缺陷。患者黏膜相關恒定T細胞(Mucosal Associated Invariant T, MAIT)、Th1、分枝桿菌特異性的Th1*(CD4+CXCR3+CCR6+ T細胞)細胞比例均降低,在Mtb刺激下記憶性CD4+T細胞產生IFN-γ的能力受損［16］。

IL-23在活化IFN-γ分泌過程中起著重要作用［20-23］。Markle等發現MSMD患者攜帶IL23R基因純合突變 c.344G>A(p.C115Y)。B淋巴細胞系表面IL-23R表達下降,突變IL-23R蛋白糖基化異常,在IL-23刺激下STAT3磷酸化作用受損。同時患者MAIT細胞、Th1、Th1*細胞群比例偏低。用Mtb的刺激患者Th1*細胞,IFN-γ分泌下降［16］。

ISG15基因是一種干擾素激活基因,其主要被IFN-α/β、感染等因素激活,從而誘導NK細胞和T細胞產生IFN-γ［24-28］。Bogunovic等研究3例MSMD患者發現兩種ISG15基因純合突變,分別為c.379G>T(p.Glu127)、c.336_337insG(p.Leu114fs)。患者感染EB病毒的B細胞(EBV-B細胞)在IFN-α刺激下ISG15分泌缺失,同時在SV40成纖維細胞中未檢測到ISG15和ISGylation,說明ISG15產生和功能均受損［27］。用BCG或BCG和IL-12刺激患者全血細胞發現IFN-γ分泌下降。

TYK2是一種JAK激酶,參與四種細胞因子(IL-12、IL-23、IFN-α和IL-10)介導的信號通路［29-31］。在對3例幼年發病的MSMD患者的研究中發現一種TYK2基因純合突變 p. P1104A。在IL-23刺激下,TYK2參與的JAK2-STAT3信號通路明顯異常,患者Th17、Th1和記憶性T細胞IFN-γ產生均下降［30］。

RORγT在Th17的分化、3型先天淋巴樣細胞的發育和γδT細胞的功能中均起關鍵作用［32-35］,可以激活IL-17A、IL-17F和IL-23R的轉錄［32,36］。Okada等研究了7例MSMD患者,其中6例患有皮膚黏膜念珠菌感染。基因分析發現3種RORC基因純合突變。轉染突變基因使HEK293T細胞的RORγ/RORγT表達完全缺失。患者MAIT細胞、NKT細胞缺乏,且γδ和αβT細胞的IL-17A/IL-22產生下降,Th17細胞分泌IL-17A顯著下降,這可能與患者同時感染皮膚黏膜念珠菌相關。在BCG和IL-12刺激下,患者Th1*細胞、γδT細胞的IFN-γ分泌量顯著下降［37］,這導致了分枝桿菌的感染。

上述8個基因的突變均能引起IFN-γ表達量下降,或同時伴有IL-12/IL-23等其它細胞因子表達下降,這些細胞因子和IFN-γ在先天性和適應性免疫中都發揮著重要作用,它們的表達下降使患者抵抗弱毒力分枝桿菌能力明顯減弱,造成弱毒力分枝桿菌易感。

1.2 影響IFN-γ免疫反應的基因 IFN-γ主要通過JAK-STAT通路發揮免疫效應,如刺激巨噬細胞活化、促進抗原提呈細胞APC呈遞抗原等,與MSMD相關的基因突變也可以直接導致IFN-γ作用能力下降,從而使其介導的免疫反應受損,與此相關的基因有IFNGR1、IFNGR2、JAK1、STAT1、CYBB。

IFNGR1和IFNGR2編碼的IFN-γR1和IFN-γR2組成IFN-γR復合物。IFN-γR1缺失會導致IFN-γ作用功能嚴重受損［38］。一項研究發現4例MSMD患者IFNGR1基因發生純合突變 c.395C>A。患者中性粒細胞、淋巴細胞表面的IFN-γR1表達缺陷,同時用IFN-γ刺激患者PBMCs其TNF-α產生也下降［39］,EBV-B細胞IFN-γR1與IFN-γ的結合能力下降［40］。除了隱性遺傳(AR)模式外,1999年研究首次發現IFN-γR1的顯性遺傳(AD)模式,盡管AD的癥狀沒有AR嚴重,AD也會導致IFN-γ抗菌作用受損,致使患者分枝桿菌易感［41］。

IFN-γR2缺失也會導致IFN-γ作用功能受損。Dorman等發現1例未接種過BCG的男性MSMD患者攜帶IFNGR2純合突變c.278-279del。在IFN-γ刺激下患者PBMC的TNF-α產生下降且STAT1磷酸化水平降低［42］。繼1998年首次發現IFNGR2基因突變,研究者陸續報道了多種純合突變以及雜合突變。盡管IFN-γR2表達沒有完全缺失［43］,雜合突變患者也能通過阻礙JAK-STAT信號通路使IFN-γ介導的免疫作用受損,致機體分枝桿菌易感。

JAK1屬于JAK家族,是一種非酪氨酸激酶。Eletto等對1例同時感染Mtb、瑪爾摩分枝桿菌和瘰疬分枝桿菌的MSMD患者的研究發現,JAK1基因存在兩個純合突變c.2198C>T(p.P733L)、c.2494C>T(p.P832S)。兩種突變均會抑制JAK1的表達。IFN-α或IFN-γ刺激患者成纖維細胞,STAT1的磷酸化水平降低。此外,與P832S相比,P733L對JAK1功能缺失的影響更嚴重。JAK1突變使JAK1-STAT1信號通路受損導致IFN-γ作用能力下降,造成患者對分枝桿菌的易感性［44］。

STAT1是STAT家族最重要的成員之一［45,46］。Dupuis等通過對2例MSMD患者研究發現STAT1基因發生雜合突變 c.2116T>C(p.L706S)。用IFN-γ刺激患者EBV-B細胞,STAT1磷酸化水平下降;IFN-γ刺激患者SV40成纖維細胞,STAT1的核轉運降低［47］。近年有研究發現STAT1新突變c.1892T>C, p.Val631Ala［48］,這些研究都表明STAT1突變可以使IFN-γ刺激介導的JAK-STAT信號通路受損,使機體更易發生胞內病原體感染［49-53］。

CYBB基因編碼吞噬細胞NADPH氧化酶的gp91phox亞基,參與調節活性氧的形成和呼吸爆發。Bustamante等發現7例MSMD男性患者攜帶兩種X染色體CYBB隱性突變XR(p.T178P、p.Q231P)。在單核細胞源性巨噬細胞中,CYBB突變通過影響gp91phox的表達致NADPH活性受損,影響該細胞的呼吸爆發。鑒于巨噬細胞的呼吸爆發是人體抵抗分枝桿菌重要的免疫機制,且IFN-γ在其中發揮重要作用［54］,故CYBB突變可以間接影響IFN-γ作用,使IFN-γ激活巨噬細胞作用受損從而導致分枝桿菌更易發生免疫逃逸。

與影響IFN-γ表達從而間接影響其作用機制的基因突變不同,上述5個基因突變的發病機制都與直接導致IFN-γ作用能力下降相關,IFN-γ相關免疫功能受損致弱毒力分枝桿菌易感。

1.3 同時影響IFN-γ表達和免疫反應的致病基因 IRF8、SPPL2A、NEMO、TBX21基因突變不僅可以使IFN-γ產生下降從而導致IFN-γ相關免疫反應受損,也可以通過直接影響IFN-γ作用能力致IFN-γ免疫相關功能受損。

IRF8編碼IRF8蛋白可以反式激活IL12B、NOS2基因轉錄。Hambleton等發現3例有BCG接種史的MSMD患者攜帶兩種IRF8突變 p.K108E、p.T80A。其中p.K108E為純合突變,患者全血細胞IFN-γ、IL-12、IL-23分泌均下降,且患者組織DC細胞、血液DC細胞和血液單核細胞嚴重缺失,同時組織巨噬細胞也出現不同程度的缺失。p.T80A為雜合突變導致CD1c+CD11c+樹突狀細胞(cDC2s)數量下降且PBMCs的IL-12、IL-23產生下降。兩種突變均會導致IRF8蛋白的反式激活功能均受損,下調IL-12B、NOS2基因的轉錄［55］。NOS2蛋白參與巨噬細胞對胞內菌非特異性的免疫防御機制,IFN-γ通過激活NF-κB、STAT1等促進NOS2的表達,并以此控制分枝桿菌的感染,IRF8基因突變使IRF8蛋白反式激活NOS2基因轉錄功能受損,同時降低IFN-γ產生水平,致使IFN-γ介導的免疫防御能力下降,分枝桿菌更易發生免疫逃逸［56,57］。

SPPL2a是一種信號肽酶,可以通過降解CD74的跨膜部分(NTF)調節APC的抗原遞呈功能。Kong等發現3例有BCG疫苗接種史的MSMD患者攜帶兩種SPPL2A基因純合突變 c.733+1G>A、c.1328-1G>A,這兩種SPPL2A突變都會導致SPPL2a蛋白水平下降,無法切割分解單核細胞和B細胞內CD74 NTF,以致CD74 NTF沉積。患者樹突狀細胞(Dentritic cell, DC)前體細胞發育受損、cDC2s細胞缺乏,其中cDC2s細胞缺乏機制可能與CD74 NTF沉積毒性有關。cDC2s細胞缺乏進一步導致IL-12、IL-23分泌下降,同時患者Th1*細胞產生IFN-γ的能力也受損［58］。SPPL2A突變可以使IFN-γ分泌下降,同時突變致CD74 NTF沉積會阻斷HLA II類蛋白向細胞表面定向轉運,從而導致IFN-γ促進APC的抗原提呈功能受損［59,60］,患者體內由IFN-γ介導的適應性免疫降低進而致患者分枝桿菌易感。

NEMO參與組成IKK復合物(與NF-κB結合的IκBα蛋白),可以激活NF-κB信號通路。Filipe-Santos等研究了3例播散性分枝桿菌感染的MSMD患兒,基因檢測發現X染色體上兩種NEMO基因隱性突變(XR):c.944 A>C(p.E315A)、c.956 G>A(p.R319Q)。在PHA刺激下,患者分泌的IL-12和IFN-γ的產生均受損。研究證實c.956 G>A患者NEMO突變可以影響單核細胞、DC細胞的c-Rel(NF-κB家族成員)的核轉運功能,通過延遲c-Rel的核轉運而進一步損害CD40激活NF-κB信號通路功能,導致IL-12產生下降從而影響IFN-γ分泌［61］,故NEMO突變不僅能降低IFN-γ產生,還能使其激活NF-κB信號通路功能受損進一步降低相關免疫作用［62,63］。

TBX21基因編碼T-bet,是一種與Th1細胞發育相關的關鍵轉錄因子,在細胞免疫機制和免疫防御中起著關鍵作用［64-66］。Yang等對1例在3個月接種BCG后發生全身播散性分枝桿菌感染的男孩進行研究發現TBX21基因純合突變(c.466_471delGAGATGinsAGTTTA;p.Glu 156_Met 157 delins SerLeu),轉染突變基因的HEK293T細胞T-bet表達明顯下降,TBX21基因抑制細胞和患者HVS-T細胞的IFN-γ產生顯著下降。患者Th1、MAIT、Vδ2+γδT、iNKT、NK細胞群比例均降低,且Th1、Vδ2+γδT、iNKT、NK細胞的IFN-γ產生均顯著下降。同時TBX21基因突變會使其下游基因的轉錄表達均下降,包括CCL1、CCL13、CCL13、CCL4、CSF2、CXCR5、GZMM、CD40、CD86、IL7R、IL-10、LTB、ITGA5以及ITGB5,下游基因中多個基因可編碼參與IFN-γ介導的免疫防御機制的免疫蛋白,故TBX21基因突變可以通過多種途徑使IFN-γ介導的免疫作用受損,同時降低IFN-γ分泌從而使患者分枝桿菌易感［8］。

上述4個基因突變在影響IFN-γ表達之外還分別影響NOS2基因表達、APC的抗原提呈功能、NF-κB信號通路等,這些功能均受IFN-γ調控,在對IFN-γ的多重影響下,患者抗弱毒力分枝桿菌能力下降。

此外,最近的研究發現與MSMD相關的新致病基因ZNFX1。ZNFX1是一種RNA結合蛋白,最近有報道稱,ZNFX1基因突變會導致嚴重的家族性免疫缺陷,干擾素能刺激ZNFX1基因表達［67］。Vavassori等對15例免疫缺陷患者進行研究,發現其中13例患者均有ZNFX1突變,包括純合和雜合突變(p.R900Mfs*5/p.H542Cfs*41、p.K133*/ p.K133*、p.C1264S/E1727Kfs*11)［68］。在另一項關于MSMD患者研究中發現兩種ZNFX1基因純合突變(p.E1606Rfs*10、p.S959*)［69］。ZNFX1能調控下游ISGs表達,患者纖維母細胞表達ZNFX1受損,胞外感染時其IFN-α、IFN-β和下游其他ISG蛋白的產生下降,患者發病機制與其體內I型和III型干擾素介導的抗感染作用受損有直接關系［68］。目前還沒有直接證據可以證明ZNFX1基因突變可以影響IFN-γ的表達和效應能力,Voyer等推測ZNFX1可能通過影響髓系細胞的某些亞群調節IL-12p70、IL-23和ISG15表達［69］,從而間接影響IFN-γ介導的炎癥反應使患者分枝桿菌易感。ZNFX1突變對IFN-γ相關免疫反應及其抗菌免疫機制仍需要進一步探索。

2 小結

目前已經發現有18種基因與MSMD相關,絕大多數基因突變可以導致先天性IFN-γ免疫缺陷以致MSMD患者易感BCG等弱毒力分枝桿菌。雖然靶向MSMD發病機制的研究取得較大的進展,但至少有50%的MSMD患者尚未發現遺傳病因［70］。如今全外顯子組測序和全基因組連鎖分析廣泛應用,有助于發現更多的致病基因并進一步闡明MSMD遺傳病因,對指導臨床診斷和治療具有重要的意義。