體外產氣法評定不同蛋白飼料原料間的組合效應

盧哲丞， 張春桃， 成述儒， 屠 焰*

（1.甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅蘭州 730070；2.中國農業科學院飼料研究所 奶牛營養學北京市重點實驗室，北京 100081）

大豆粕作為目前我國畜禽飼料中應用最為廣泛的植物性蛋白質飼料原料，每年消耗量很高，難以自給自足（鄭祖庭，2019），致使大豆進口量逐漸攀升，進口依賴度居高不下。近年來受中美貿易摩擦及全球新冠大流行的影響，大豆及其副產品的國際貿易受阻，嚴重影響了我國的飼料行業（He等，2019）。大豆粕等飼料原料的價格波動不斷，進一步增大了畜牧養殖成本，實施大豆減量計劃已成為國家、農業農村部及行業重點關注的問題（薛俊敬等，2019）。充分利用非常規蛋白飼料資源（如菜籽粕、棉籽粕等）替代大豆粕，進而減少對大豆粕需求是大勢所趨，但受抗營養因子的影響使得雜粕整體的營養性及適口性較差（Le等，2021；Yusuf等，2021），因此，用其替代大豆粕時應注意適宜的添加比例，以免影響畜禽的采食及健康。

體外產氣法由Menke等（1988）所提出，是一種借助產氣管等體外產氣裝置來模擬反芻動物瘤胃內部的發酵過程，并通過測定飼草料的體外發酵產氣量，進而評定其營養價值的試驗方法，相比傳統的動物試驗而言更為簡便，且數據重復性更好，應用已十分廣泛。我國在1983年開始在奶牛的相關研究上使用此方法 （丁角立等，1983）。Sallam等（2007）通過體外產氣法驗證了不同飼草料的體外產氣量與其營養物質消化率的關系，進一步驗證了通過體外產氣試驗證明飼草料營養價值的可行性。本研究針對飼料中雜粕替代大豆粕的現實問題，通過體外產氣法評定了不同比例的菜籽粕、棉籽粕及大豆粕等蛋白飼料原料間的組合效應，提出雜粕替代大豆粕的適宜比例，為進一步開展的飼料大豆粕減量提供理論依據，減緩畜牧養殖成本及壓力。

1 材料方法

1.1 試驗材料 精料飼料原料為玉米、大豆粕、麩皮、菜籽粕、棉籽粕和干酒糟及其可溶物（DDGS），混以10%預混料；粗飼料原料為苜蓿和全株玉米青貯。所有飼料原料均購自內蒙古富川飼料科技股份有限公司，10%預混料購自北京精準動物營養研究中心有限公司。

1.2 試驗日糧 本試驗將精料和粗料按各自原料比例配制好后，再以精粗比為60：40混合配制成7種不同配方組合的飼糧，試驗飼糧組成及原料營養水平見表1和表2。

表1 試驗飼糧組成（干物質基礎）

表2 飼糧原料營養水平（風干基礎）%

1.3 試驗動物及樣品的采集 本試驗于中國農業科學院南口中試基地開展。瘤胃液取自3頭體重相近、健康無病且裝有永久性瘺管的荷斯坦干奶牛，試驗期3 d，每天飼喂全混合飼糧（TMR）兩次（07：00、16：00），自由采食和飲水。于晨飼前1 h通過瘤胃瘺管采集瘤胃內容物，經4層紗布過濾至已預熱的39℃保溫瓶內迅速帶回實驗室，用于后續體外發酵。TMR組成及營養水平見表3。

表3 TMR組成及營養水平（干物質基礎）

1.4 體外發酵 體外發酵采用DSHZ－300A水域恒溫振蕩器裝置，稱取約0.200 g組合飼糧樣品于已涂抹凡士林的玻璃注射器內管中進行體外產氣試驗，每樣品6個重復，每重復6支，并設置3支空白管。采用Menke法（1998）配制人工瘤胃液，并將人工瘤胃液與瘤胃液按體積比2：1混合，作為培養液。通入二氧化碳（CO2）排除空氣，同時用分液器向培養管分裝30.00 mL培養液，排除氣泡，放置39℃恒溫振蕩培養箱中進行培養并開始計時。當培養至0、2、4、8、12、16、24、32、36、40、48、56、64 h及72 h時間點時，取培養管快速讀取活塞所處的刻度值并記錄。培養24 h后，每組各重復快速取3支培養管放入冰水浴中，發酵停止。將培養管中發酵液排出至對應編號的10.00 mL離心管中，用已校準的pH計測定pH并記錄。發酵液經低溫離心（4℃，8000g及15 min）后，取上清液冷凍保存，以備其他發酵參數［氨態氮（NH3-N）和微生物蛋白（MCP）產量］測定，每組各重復剩余的3支培養管至72 h時終止培養。

1.5 測定指標及方法

1.5.1 常規營養成分 測定的常規營養成分包括：干物質（DM），將粉碎風干后的樣品至于105℃烘箱中烘干3 h后測定；粗灰分（Ash），將樣品置于馬弗爐內550℃灼燒8 h后測定；粗蛋白質（CP），采用FOSS DumatecTM-8000定氮儀測定；粗脂肪（EE），采用ANKOM-XT15i全自動脂肪分析儀測定；中性洗滌纖維（NDF）及酸性洗滌纖維（ADF），采用ANKOM-2000i全自動纖維分析儀測定；鈣（Ca）和磷（P），采用FOSS NIRS DS-2500近紅外分析儀測定。

1.5.2 體外累計凈產氣量的計算 凈產氣量的計算公式如下：

凈產氣量=某一時間段產氣量-對應時間段內3支空白管的平均產氣量。

1.5.3 體外產氣動力學參數計算 記錄底物在不同 時 間 點（0、2、4、8、12、16、24、32、36、40、48、56、64 h及72 h）的產氣量，產氣模型計算公式：Y=B（1-e-ct），式中：Y、B及c分別為t時間點0.200 g組合飼糧樣本累積產氣量、理論最大產氣量及產氣速度。

1.5.4 發酵液pH 采用經標準液校準的德圖Testo 206 pH計測定體外發酵液的pH。

1.5.5 發酵液NH3-N的測定 應用屯妮薩（2012）的方法用堿性次氯酸鈉-苯酚分光光度法測定發酵液中的NH3-N濃度。

1.5.6 微生物蛋白產量的測定 MCP產量的測定采用嘌呤法，利用酵母RNA做標準曲線，采用分光光度計測定其吸光度值，計算微生物蛋白質量濃度：

微生物蛋白氮=RNA測定值×RNA含氮量/細菌中RNA含氮量×稀釋倍數；

微生物蛋白產量=微生物蛋白氮×6.25。

1.6 數據統計與分析 所有數據先采用Excel 2010進行初步整理得到凈產氣量，使用SAS 9.2處理軟件NLIN（Nonlinear regression）程序計算B和c等發酵參數，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）程序進行分析。差異顯著性用Duncan氏法進行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結果

2.1 體外產氣量 從表4可見，0～72 h各時間點的產氣量總體呈遞增趨勢，但48～72 h時增速相對較慢，組合5除2 h和4 h外，其他各時間點的累計產氣量均高于其他組（P＜0.05），2 h時產氣量最高的為組合1，為17.50 mL，4 h時產氣量最高的為組合4，為25.66 mL。組合6各時間點的累計產氣量均低于其他組（P＜0.05），0～72 h各組合的累積產氣量最大的是組合5，為70.67 mL（P＜0.05），最小的是組合6，為34.83 mL（P＜0.05），其他組合的產氣量從多到少依次為組合4＞組合7＞組合2＞組合1＞組合3，產氣量分別為66.67、64.17、63.03、48.17 mL和40.83 mL。

表4 體外發酵累計產氣量mL

2.2 產氣曲線 從圖1可以看出，不同精粗料組合在各時間點產氣量的動態變化，均呈產氣加速度由慢到快，再到增速趨于0逐漸呈平緩的趨勢。組合5較其他組合上升速度快之后趨于緩慢；其他組合于0～4 h產氣量上升緩慢，4～48 h的體外產氣量上升較快，之后趨于平緩。組合5產氣速度最快且產量最大，其他組合的體外產氣均有較長的延滯期。組合6的總產氣量最少。

圖1 體外產氣曲線

2.3 體外產氣動力學參數 由表5可見，底物的產氣動力學參數與體外產氣曲線相對應，各組的理論產氣量與實際產氣量相接近，組合5的理論產氣量最大，為67.583 mL，其次是組合4、組合7和組合2，分別為63.950、62.810 mL和61.633 mL，四者差異不顯著（P＞0.05）；但顯著大于其他飼糧樣品的理論產氣量（P＜0.05），組合6的理論產氣量最小，為39.013 mL（P＞0.05）；體外產氣速度最快4個組合分別為組合5＞組合4＞組合2＞組合3，分別為0.105、0.103、0.093、0.092 mL/h，顯著高于組合1和組合6（P＜0.05），組合6產氣速度最慢，為0.053 mL/h（P＜0.05）。

表5 體外產氣動力學參數

2.4 24 h發酵液發酵參數 由表6可見，24 h發酵液的pH為6.32～6.48，最高的4個組合依次為組合1＞組合7＞組合2＞組合6，四者差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于其他組合（P＜0.05）；24 h發酵液的NH3-N濃度為19.11～33.17 mg/100 mL，組合3的發酵液NH3-N濃度為33.17 mg/100 mL，顯著高于其他各組（P＜0.05），組合6最低，為19.11 mg/100 mL；各組24 h發酵液的MCP產量最高的為組合2，為1.04 mg/100 mL，組合6發酵液的MCP產量顯著低于其他組合，為0.88 mg/100 mL（P＜0.05）。

表6 24 h發酵液發酵參數

3 討論

3.1 體外產氣量及產氣曲線 體外發酵產氣的來源主要是通過發酵液中的瘤胃細菌等微生物與底物（如碳水化合物）發酵產生的CO2、CH4等氣體，體外產氣量的高低不僅反映了飼草料的營養價值，同時也反映了微生物的活力及對營養物質的利用率（金恩望等，2012）。從體外產氣曲線可看出，本試驗中各組合飼糧的體外產期量均經歷了增加速度由慢到快，再到增速趨于0逐漸呈平緩的趨勢，這與李文娟等（2016）對5種甘蔗副產物所測定的體外產氣趨勢相一致。其主要原因可能是發酵初期微生物主要與飼草料植物細胞的細胞壁發生反應，而細胞壁中的糖類等碳水化合物含量較少且分解速度較慢，進而導致產氣量及產氣速度較慢，后期與含糖量較高的細胞液進行發酵反應從而使得產氣量提升加快（趙慶新和袁生，2007）。孟梅娟（2015）通過研究不同非常規飼料資源組合的體外瘤胃體外發酵特性發現，各組的產氣量與其有機物的含量呈正相關，本研究的結果與其基本一致。周玲等（2017）通過體外產氣法評定空心菜、木薯桿等6種飼草料的營養價值發現，各草料的產氣量與其消化率及營養價值等呈正相關，產氣量越高的草料其相對飼用價值越高，而本試驗在保證飼糧精粗比為60：40的情況下，產氣量最高的飼糧組合為玉米∶麩皮∶棉籽粕∶菜籽粕∶DDGS=60∶15∶5∶5∶5，苜蓿：全株玉米青貯=10∶30，這說明飼糧中使用適量的棉籽粕、菜籽粕及DDGS代替的大豆粕后仍具有一定的飼喂價值。

3.2 體外產氣動力學參數 本試驗中所有組合飼料樣本的72 h實際產氣量與理論產氣量基本一致。Nsahlai等（1994）通過體外產氣法評定田菁的營養價值發現，其理論產氣量與中性洗滌纖維、半纖維素及木質素的含量呈負相關，其原因是纖維、木質素等結構較為致密，會影響糖類等營養物質的釋放，本試驗的研究結果與其基本一致。湯少勛等（2006）將體外產氣法進行一定的改進后，利用其評定了10種牧草的體外產氣特性發現，各牧草的累計產氣量及理論產氣量與牧草中CP的含量均呈負相關關系，本試驗中玉米∶麩皮∶大豆粕∶棉籽粕∶菜籽粕=60∶15∶5∶5∶5，苜蓿：全株玉米青貯=10∶30組合飼糧的累計產氣量及理論產氣量均為最低，且該組合中的大豆粕、菜籽粕及棉籽粕的CP含量均高于DDGS，飼糧整體CP含量也較高，驗證了此結論。

3.3 體外發酵參數 酸度是瘤胃發酵參數的重要指標之一，與動物采食飼糧的類型、瘤胃的健康狀況及其中VFA、NH3-H的濃度等均有一定關系。瘤胃中的pH對維持瘤胃內環境穩定起到至關重要的作用，pH過低會造成動物瘤胃酸中毒，過高則會降低瘤胃微生物的活性，影響營養物質的消化及吸收（尹夢潔，2021）。Rodrigues等（2020）研究表明，瘤胃微生物最適宜的pH為6.1～7.2，而本試驗各組和飼糧的體外發酵pH均在6.3～6.5，說明各組合飼糧進入瘤胃后均未對瘤胃內環境產生不良影響。同時有研究表明，反芻動物瘤胃中的pH與其采食飼糧的纖維含量呈一定正相關關系（王海榮等，2008），這與本試驗的結果有一定差異，本試驗中pH最高的飼糧組合為不含雜粕的單一大豆粕組，且大豆粕的纖維含量要低于菜籽粕及棉籽粕，但瘤胃中的pH受到試驗動物、飼糧、飲水及瘤胃中的VFA、NH3-H濃度等多種因素的共同影響，對此有待進一步研究證實。

NH3-H濃度是反映反芻動物瘤胃中氮代謝程度的重要指標，瘤胃微生物合成蛋白質的主要氮源就是NH3-H（焦光月等，2015），但NH3-H濃度若過高不僅是對養分的一種浪費，同時也會造成瘤胃內環境的pH偏高，不利于瘤胃微生物的生長及繁殖。研究表明瘤胃中NH3-H的濃度范圍為7～34 mg/dL（Illius，1989），本試驗中各組合飼糧體外瘤胃發酵液的NH3-H濃度均在此范圍內。李金輝等（2022）研究表明，使用一定比例的棉籽粕替代飼糧中的大豆粕進行體外發酵后，發酵液的NH3-H濃度有所升高，而本試驗中單一大豆粕組飼糧相比于添加棉籽粕飼糧的NH3-H濃度偏低，與該研究結果相一致，這可能與棉籽粕中的棉酚等物質限制了瘤胃微生物對NH3-H的降解及利用有一定關系。MCP是反芻動物機體每日消耗蛋白質的重要供應源，其質量濃度可以反映瘤胃中NH3-H的分解及利用程度，同時也一定程度的反映了瘤胃中細菌等微生物的種群多樣性及大小（于錦皓等，2018）。本試驗在保證精粗比為60∶40的情況下，除玉米∶麩皮∶大豆粕∶棉籽粕∶菜籽粕=60∶15∶5∶5∶5，苜蓿：全株青貯玉米=10∶30該組合飼糧體外瘤胃發酵液的MCP質量濃度顯著低于其他各組外，其余各組間差異均不顯著，說明該組的體外瘤胃發酵液中的微生物種群較小，其他無明顯差異。

4 結論

在本試驗條件下，不同組合比例的粗料代替豆粕體外發酵72 h時，玉米∶麩皮∶棉籽粕∶菜籽粕∶DDGS=60∶15∶5∶5∶5，苜蓿：全株青貯玉米=10∶30時組合效果最佳，可有效提高其營養成分的互補、瘤胃發酵水平，但其具體營養價值還需要通過動物試驗進行驗證。