西澳菲斯特農場赤桉蜂蜜促進感染創面愈合作用研究

陳艷欣，林韋康*

（1.王叔和（鄭州）生物制藥工程有限公司，河南 鄭州; 2.王叔和生物醫藥（武漢）有限公司，湖北 武漢）

蜂蜜藥用自古就有記載，例如古希臘的醫師希波克拉底和中國古代的藥圣李時珍，都曾記錄過蜂蜜作為藥物使用，是人類已知的最古老的傷口敷料。在第一次世界大戰期間，蜂蜜被俄羅斯和中國士兵用于傷口護理。傷口無論是手術中的手術切口，或者是由于意外和創傷造成的傷口，都面臨著外界細菌定植、感染的威脅。細菌存在于人體皮膚的各個角落，在正常情況下不會引起感染。當皮膚和粘膜屏障受損時，它們會侵入、生長、繁殖和分泌毒素，隨著愈合時間的推移，這會逐漸導致急性/慢性感染性傷口的形成。然而，數十年來抗生素的過度使用和誤用改變了細菌的基因，導致耐藥菌株的出現，甚至產生了多藥耐藥性[1]。因此，迫切需要開發新的抗菌劑來解決創面細菌感染問題。

隨著現代抗菌藥物耐藥性的出現，天然的抗菌活性和促進傷口愈合的特性使蜂蜜的相關研究逐漸成為焦點。本文就西澳菲斯特農場赤桉蜂蜜研究了其抗菌活性和促進感染創面愈合的效果。

1 實驗材料

1.1 實驗藥品及試劑

西澳菲斯特農場赤桉蜂蜜，由洋妝源（上海）網絡科技有限公司提供；市售蜂蜜，采購于國內一線城市；胎牛血清、DMEM高糖培養基、0.25% Trypsin-EDTA、磷酸鹽緩沖液（PBS），Gbico 公司；營養瓊脂，國藥集團化學試劑有限公司；LB 肉湯、水合氯醛，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 實驗儀器

XPR 電子分析天平，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；HOPE-MED 8140 紫外輻照燈，天津開發區合浦工貿有限公司；BX63-CellSens 型全電動智能顯微鏡，日本Olympus 公司；BOCL 101 液相色譜儀，日本島津公司；BIO-RAD680 型酶標儀，美國BIO-RAD 公司。

1.3 實驗細胞、細菌和動物

HDF 細胞，美國組織細胞庫；金黃色葡萄球菌（ATCC6538）；大腸桿菌（ATCC9739）。SD 大鼠，雄性，SPF 級，個體質量（350±2）g，6～8 周齡，購買于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0008。動物在（23±1）℃的環境中，在相對濕度（55±15）%的條件下，12 h 的循環光照條件下，可以自由地取食和喝水。

2 實驗方法

2.1 細胞增殖實驗

以5×104個/孔的密度，將HDF 細胞接種在96孔板中，培養24 小時。PBS 洗滌3 次，加入含不同濃度西澳菲斯特農場赤桉蜂蜜（40% 、60%、80%、100%）、市售蜂蜜（40%、60% 、80%、100%）的完全培養基，培養12 h 后，采用CCK-8 法測定細胞活力，來確定西澳菲斯特農場赤桉蜂蜜和市售蜂蜜對HDF 細胞無毒性作用的安全劑量的范圍。

2.2 細胞活力的測定

移除待測96 孔板中的含有藥物的完培，加入PBS 洗滌細胞。吸取PBS，加入100 μL 含有10%CCK-8 的新鮮培養基，移入培養箱孵育合適的時間后，使用酶標儀測定450 nm 波長處的吸光度。計算細胞存活率的公式如下：

細胞存活率（%）=（樣品組OD 值- 空白組OD值）/（對照組OD 值- 空白組OD 值）*100%

2.3 抑菌實驗

供試菌懸液的準備:取各菌(細菌)的12 h 的肉湯培養物，按10 倍稀釋法，用0.9%無菌生理鹽水溶液稀釋一定的倍數，制備濃度相當于0.5 麥氏標準比濁管的供試菌懸液(含菌1.0×108～1.5×108CFU/mL)，生理鹽水稀釋，使之含菌量為1×107CFU/mL，備用。

PBS 和各蜂蜜稀釋液準備：PBS 組、西澳菲斯特農場赤桉蜂蜜組和市售蜂蜜組的稀釋方法相同，用PBS稀釋到80%（v/v），備用。

取450 μL 菌懸液（1×107CFU/mL）分別加入50 μ 稀釋后的PBS 后的蜂蜜。37 ℃共培養4 h。取培養后的試驗菌懸液，根據菌落數量的多少，稀釋適當的倍數后，用移液器吸取20 μL，均勻涂布在瓊脂板上，37 ℃培養12 h 后，取出進行菌落計數。

抑菌率=（空白組菌落數- 試驗組組菌落數）/空白組菌落數*100%

2.4 體內感染創面修復實驗

將6 只SD 大鼠用5%水合氯醛麻醉，剃除毛發，消毒后用打孔器制造出6 個等大的全層切除創面（直徑10 mm）。在創面處接種20μL 金黃色葡萄球菌懸液（1×107CFU/mL），每天接種2 次，連續接種2 天，制造創面感染模型。將每只小鼠背部的6 個隨機分為3組：陰性對照（PBS 組），陽性對照（市售蜂蜜組），實驗組（FFJH 組），每組12 個創面。每天每組各自給藥100 μL，連續14 天。于給藥治療第1、3、7 天取各組創面菌落，稀釋涂板，計算各組相應天數的菌落數。于給藥治療第1、3、7、14 天測量創面面積，并統計。

創面愈合率=（初始創面面積- 現有創面面積）/初始創面面積*100%

2.5 數據統計分析

實驗數據至少重復3 次，結果以Means±SEM 表示。利用Graphpad prism 8.0 進行分析，統計結果P＜0.01 認為有顯著性差異。

3 結果與分析

3.1 FFJH 對HDF 細胞增殖的影響

皮膚成纖維細胞是組成皮膚真皮的主要結構成分，可合成和分泌膠原蛋白、纖連蛋白、透明質酸等細胞外基質，在確保皮膚正常功能和創面修復的方面起著重要作用[2]。由圖1 可知，在作用24 h 后，80%（v/v）的FFJH 可以顯著促進HDF 的增殖（P＜0.01）。因此，選用80%（v/v）的FFJH 進行后續實驗評估。

圖1 FFJH 對HDF 細胞增殖的影響

3.2 FFJH 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用

FFJH 對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果，見圖2，與PBS 組相比，FFJH 在體外可以有效抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長（P＜0.01）。

圖2 體外抑菌率(a: 金黃色葡萄球菌; b: 大腸桿菌)

3.3 FFJH 加速感染創面愈合

FFJH 對SD 大鼠感染金黃色葡萄球菌創面愈合的影響見圖3，與PBS 組愈合緩慢相比，FFJH 組的感染創面愈合速度顯著加快（P＜0.01），表明FFJH 可以加速SD 大鼠感染創面愈合。

圖3 感染創面愈合率

3.4 FFJH 抑制感染創面金黃色葡萄球菌的生長

為了評價FFJH 在體內的抑菌能力，第1、3、7 天從感染創面取樣獲得的金黃色葡萄球菌被涂板培養24 小時、計數。菌落數見圖4，在干預后第7 天時，PBS組菌落數較高，說明感染創面中金黃色葡萄球菌數目依舊較多，生長旺盛。與PBS 組相比，FFJH 組的菌落數顯著降低（P＜0.01），感染的皮膚顯示出少量細菌生長，這表明FFJH 在體內對金黃色葡萄球菌依舊具有明顯的抑菌活性。

圖4 感染創面樣本菌落數

4 結論

4.1 FFJH 可以促進HDF 細胞增殖

在創面修復過程中，機體需要創面邊緣的成纖維細胞快速增殖、并向創面中心遷移，并分泌膠原蛋白等細胞外基質，為傷口床中央肉芽組織的生長與恢復創造有利條件。現有的研究結果表明，蜂蜜可以通過刺激成纖維細胞的增殖，進而加速組織再生[3]。在本研究結果中，可以明顯看出80%（v/v）的FFJH 可以促進HDF 增殖，對創面修復有重要意義。

4.2 FFJH 抑制體外大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的增殖

創面修復過程中最常遇到的問題是細菌感染，外部細菌一旦在創面處生長達到臨界閾值就會極大程度上阻礙創面修復的過程，其中最常見的是金黃色葡萄球菌[4-5]。FFJH 在體外有很好的抗金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的能力，且天然無公害，不會產生耐藥性。

4.3 FFJH 可以抑制創面區域金黃色葡萄球菌的增殖并加速感染創面修復

蜂蜜在淺表燒傷和無感染的全層傷口以及實驗性感染金黃色葡萄球菌的傷口中使用能減少炎癥，使傷口更快地愈合[6]。在本研究中，80%（v/v）的FFJH 覆蓋在皮膚缺損部位，能有效殺死創面的細菌，不產生耐藥性，有效減少創面區域金黃色葡萄球菌的增殖，加速大鼠感染性創面的愈合。雖然具體的作用機制可能需要進一步探究，但此研究充實了天然物質用作創傷修復的敷料成分，擴大了抗生素替代品種類，為探詢FDA 級醫療蜂蜜申報提供先驅性的研究指導價值。

西澳菲斯特農場赤桉蜂蜜與傳統抗菌藥物和敷料相比更天然，對人體無毒副作用，不會產生耐藥性。作為感染性創面治療的優良藥物，有廣闊的應用前景。