沙棘花青素提取物對雙氧水誘導的H1299細胞損傷的保護作用及Nrf2/HO-1通路的影響

鄭玉榮，陳 龍，王 曉，李 軍 ，李寶國

（1.山東中醫藥大學，山東濟南 250355；2.齊魯工業大學（山東省科學院）山東省分析測試中心，山東濟南 250014）

沙棘為胡頹子科沙棘屬沙棘Hippophae rhamnoidesL.的干燥成熟果實，2020版《中國藥典》記載其具有健脾消食、止咳祛痰、活血散瘀的作用[1]。沙棘中含有多種活性成分，包括黃酮類、萜類、甾醇類、揮發油類、多糖類等成分，另外還含有豐富的維生素、氨基酸和微量元素，在食品和醫療保健領域應用較為廣泛[2]。藥理學研究表明，沙棘具有抗炎[3]、抗氧化[4?6]、抗腫瘤[7?8]、抗衰老[9]、保肝[10]、抑菌[11]等作用。大量文獻顯示沙棘果實中含有較多的原花青素，其主要由不同數量的兒茶素和表兒茶素結合而成，含量可達90%以上[12?14]。沙棘原花青素不僅具有較強的抗氧化作用，還具有保護心血管、抗衰老和抗潰瘍的作用[15?17]。

目前原花青素因具有多種藥理活性，而被應用于多種疾病的治療中[18]。研究表明，原花青素可以顯著降低腎病小鼠的組織氧化損傷[19]。此外，有研究人員通過構建百草枯誘導的肺部纖維化損傷模型，研究了花青素對肺部纖維化損傷的影響，結果表明花青素能夠降低肺部纖維化損傷，其作用機制可能與抑制上皮間充質轉變有關[20]，并且有研究表明，沙棘提取物可以通過提高抗氧化酶活性，減少脂質過氧化物的產生，從而降低小鼠肺組織氧化損傷[21]。上述研究均表明，花青素對于機體內肺組織氧化損傷具有良好的保護作用，然而其作用機制仍有待研究。因此，本研究利用過氧化氫誘導的人非小細胞肺癌H1299細胞氧化損傷模型，研究HRAE對H1299細胞氧化損傷的保護作用，并探討沙棘花青素提取物對肺組織氧化損傷保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘藥材 亳州市華云中藥飲片有限公司，經山東中醫藥大學李寶國教授鑒定符合2020版中國藥典規定；H1299人非小細胞肺癌細胞株 上海中喬新舟生物科技有限公司；青鏈霉素、二甲基亞砜、雙色預染蛋白Marker、胰蛋白酶-EDTA消化液（胰蛋白酶0.25%，EDTA 0.53 mmoL） 北京索萊寶生物技術有限公司；DMEM/High Glucose 武漢賽維爾生物科技有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白測定試劑盒、丙二醛試劑盒、谷胱甘肽試劑盒、活性氧檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒 碧云天生物技術有限公司；四季青胎牛血清 浙江天杭生物科技股份有限公司；β-actin抗體、Nrf2抗體、HO-1抗體、SOD1抗體、NQO1抗體、KEAP抗體、PPARγ抗體、P44/42 MAPK抗體 美國CST公司；正丁醇、無水乙醇、鹽酸 天津市科密歐化學試劑有限公司；硫酸鐵銨（0.5%）、原花青素標準品 阿拉丁。

HF90二氧化碳培養箱 上海力升科學儀器；Eclipse Ts2倒置顯微鏡 日本Nikon公司；HFsafe-1200LC生物安全柜 上海力升科學儀器有限公司；ChemiScope 6000 Touch一體式化學發光成像系統上海勤翔科學儀器有限公司；Spark多功能酶標儀瑞士Tecan公司；湘儀離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；PowerPac300型電泳儀、170-3930型轉膜儀 美國BIO-RAD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HRAE的提取及純度測定 參照NY/T 2640-2014《植物源性食品中花青素的測定 高效液相色譜法》的提取方法，提取沙棘中花青素，具體過程如下：干燥的沙棘果用高速粉粹機粉碎后，過四號篩，備用；精密稱取沙棘果樣品約1.0 g于50 mL容量瓶中，加入體積比為2:1:1的無水乙醇、水、鹽酸混合液至刻度線，超聲處理（36 ℃，240 Hz）30 min，在10000 r·min?1的轉速下離心10 min，取上清液濃縮，凍干得HREA固體粉末。參照文獻[22]方法并加以改進，對沙棘花青素提取物的純度進行測定，以原花青素含量計。

沙棘花青素提取物原花青素含量[22]：精密稱定原花青素標準品10 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為1.0 mg.mL?1的標準儲備液。分別精密量取原花青素儲備液0.00、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。然后在各濃度梯度中取1 mL于具塞錐形瓶中，分別加入6 mL鹽酸-正丁醇溶液（5:95），再分別加入0.2 mL硫酸鐵銨溶液，沸水加熱40 min，立即置于冷水中冷卻15 min，在波長546 nm下檢測，制作標準曲線。

供試品溶液：精密稱取凍干后HREA固體粉末10 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，備用。取1 mL用甲醇稀釋10 mL，然后取1 mL稀釋液按標準曲線制作方法操作，以相應試劑為空白，重復測定兩次。計算公式：

式中：W表示試樣中原花青素含量，%；c表示混合物中原花青素濃度，μg·mL?1；V表示待測樣品總體積，mL；V1表示樣液反應體積，mL；V2表示樣液反應后體積，mL；m表示試樣所代表的沙棘花青素提取物質量，mg。

1.2.2 細胞培養 取凍存的H1299細胞，37 ℃水浴快速融化后置于15 mL離心管中，1500 r·min?1，離心5 min；棄去上清液，將H1299細胞置于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養液中，放入37 ℃、5% CO2培養箱中培養。待細胞長滿80%后進行傳代培養。

1.2.3 H1299細胞氧化損傷模型的建立 取對數生長期的H1299細胞，以每毫升1×105個細胞密度，每孔100 μL接種于96孔培養板中，培養24 h后，棄去上清，分別加入100 μL不同濃度的雙氧水溶液（800、400、200、100 μmol·L?1），繼續培養4 h后，分別加入MTT溶液（1 μg·mL?1）50 μL，繼續培養4 h后在490 nm下檢測各孔吸光度，計算細胞活力，計算公式：

式中：A加藥表示藥物組溶液的孔的OD值；A0加藥表示空白組溶液的孔的OD值；A空白表示沒有細胞的孔的OD值。

1.2.4 HREA對細胞活力的影響 取對數生長期的H1299細胞，以每毫升1×105個的細胞密度，每孔100 μL 接種于96孔培養板中培養24 h后，棄去上清，分別加入100 μL不同濃度的HREA溶液（50、100、200、400、800 μg·mL?1），每組6個復孔，繼續培養24 h后加入MTT溶液（1 μg·mL?1）50 μL，培養4 h后在490 nm檢測各孔吸光度，計算細胞活力（計算公式同1.2.3）。

1.2.5 HREA對H2O2損傷H1299細胞活力的影響取對數生長期的H1299細胞，以每毫升1×105個密度將細胞接種于96孔板，培養24 h后，加入100 μL用含5%胎牛血清的DMEM培養液稀釋的質量濃度為50、100、200 μg·mL?1的沙棘原花青素，每個濃度重復6孔，對照組只加含5%胎牛血清的DMEM培養液，繼續培養24 h后，每孔加入含過氧化氫的基礎培養基100 μL，使終濃度為200 μmol·L?1，空白組加入100 μL的DMEM培養液，培養4 h后，每孔加入50 μL的MTT溶液培養4 h，棄去上清液后每孔加入100 μL二甲基亞砜，在吸光度490 nm下進行檢測，計算細胞活力（計算公式同1.2.3）。

1.2.6 HREA對細胞內MDA含量及SOD、GSH-Px、CAT 活力的測定 取對數生長期細胞，胰酶消化后按照每孔1×105的密度接種在6孔板中，培養24 h后，分別配制沙棘花青素提取物低（50 μg·mL?1）、中（100 μg·mL?1）、高（200 μg·mL?1）三個劑量，繼續培養24 h后，除空白組外均加入200 μmol·L?1的雙氧水溶液，繼續培養4 h后，分別吸取細胞上清液，檢測MDA含量。另外，每孔加入1 mL預冷的PBS緩沖液，利用細胞刮刀刮取細胞，使細胞懸浮，然后在4 ℃，11000 r·min?1條件下離心10 min，棄去上清，每孔加入60 μL RIPA裂解液，用RIPA裂解液裂解0.5 h后，相同條件下進行離心，離心后取上清液，分別按照試劑盒的說明書，檢測SOD、GSH-Px及CAT的活力。

1.2.7 HREA對細胞內活性氧的影響 按照1.2.6上述分組進行種板及給藥，加入雙氧水4 h后棄去上清液，按照活性氧試劑盒說明書，用2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）熒光探針法檢測細胞內ROS的含量，熒光顯微鏡下拍照。活性氧陽性對照Rosup是一種活性氧陽性誘導藥物，濃度為50 mg.mL?1，根據其熒光信號強度，可分析活性氧的實際水平。

1.2.8 Western Blot 按照1.2.6上述分組進行種板及給藥，加入雙氧水4 h后棄去上清液，用預冷的PBS洗滌三次，加入60 μL的RIPA裂解液，裂解半小時后刮取細胞，11000 r·min?1離心15 min后，取上清液，采用蛋白定量測定試劑盒測定后加入Loading Buffer混合，煮沸5 min變性。取蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉1 h，洗膜，一抗封閉4 ℃過夜，TBST洗滌三次，37 ℃加入HRP標記的山羊抗兔IgG孵育1 h，顯影，以β-Actin作為內參，分析各蛋白相對表達量。

1.2.9 沙棘花青素提取物關鍵藥效成分與疾病相關靶點的分子對接 在TCMSP數據庫（https://tcmspw.com/tcmsp.php）、PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索表兒茶素和兒茶素的2D結構，存為mol2格式，導入Chemdraw 14.0軟件中對各化合物分子進行能量最小化，并利用AutoDock Tools軟件將其格式轉換為pdbqt 后保存，作為配體備用。借助RCSB數據庫（https://www.rcsb.org/）檢索Nrf2（Q9Z2X8）靶點的蛋白序列，下載并保存，運用AutoDock 2.0軟件對蛋白進行去水、加氫、添加原子電荷和設置原子類型，存為pdbqt格式，作為受體備用。最后，利用AutoDock 2.0軟件對化合物與受體蛋白分別進行分子對接，并用Pymol軟件將對接模式可視化，對各組間的結合能大小進行分析比較。一般認為，結合能<0 kJ·mol?1則配體與受體能夠自由結合，并且結合能數值越小則結合能力越強，該活性成分為發揮藥效的關鍵成分。在Discovery Studio中打開分子對接結果文件，設定參數，保存分析結果。

1.3 數據處理

實驗數據采用Graphpad prism 5.0統計軟件進行統計學分析作圖，實驗做3次重復，以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 沙棘花青素含量測定結果

根據原花青素標準曲線測定法繪制標準曲線，用最小二乘法得到回歸方程為y=0.0029x+0.1253，其決定系數R2=0.9948，沙棘花青素提取物中原花青素含量的平均值為8.71%。

2.2 雙氧水誘導的H1299細胞損傷模型

由圖1可知，與正常組相比，分別采用不同濃度的雙氧水作用H1299細胞4 h后，細胞活力均出現不同程度的下降，在濃度達到200 μmol·L?1時，細胞活力在60%左右，出現極其顯著的下降（P<0.001）。由于濃度在200 μmol·L?1時細胞活力保持在60%左右，因此后續試驗選取200 μmol·L?1雙氧水作用4 h，建立H1299細胞氧化損傷模型。

圖1 雙氧水對H1299細胞活力的影響Fig.1 Effect of hydrogen peroxide on H1299 cell viability

2.3 沙棘花青素提取物對H1299細胞活力的影響

由圖2可知，不同濃度的沙棘花青素提取物對H1299細胞的活力具有不同的影響，與正常組相比，作用24 h后，在濃度達到200 μg·mL?1后，細胞活力呈現顯著或極顯著上升的趨勢（P<0.05或P<0.01），表明沙棘花青素提取物對細胞無明顯抑制作用。后續實驗證明，濃度為200 μg·mL?1時，藥效顯著（P<0.05），因此后續實驗選取50～200 μg·mL?1進行后續研究。

圖2 沙棘花青素提取物對H1299細胞活力的影響Fig.2 Effect of anthocyanins from Sea-buckthorn on H1299 cell viability

2.4 HRAE對雙氧水誘導的H1299細胞保護作用

由圖3可知，與模型組相比，沙棘花青素提取物對細胞氧化損傷具有明顯的保護作用，并且呈現劑量依賴性，濃度在200 μg·mL?1時的藥效極顯著（P<0.01），因此后續實驗選取50～200 μg·mL?1。當濃度達到100～200 μg·mL?1時，沙棘花青素提取物對H1299細胞氧化損傷的保護作用表現出較為突出的水平（P<0.05或P<0.01）。

圖3 HRAE對雙氧水誘導的H1299細胞保護作用Fig.3 Protective effect of HRAE on H1299 cells induced by hydrogen peroxide

2.5 HRAE對H1299細胞內MDA、SOD、GSH-Px和CAT表達的影響

由圖4可知，與正常組相比，模型組細胞MDA含量上升極其顯著（P<0.001），SOD、GSH-Px和CAT活性顯著降低（P<0.05或P<0.001）；與模型組比較，HRAE低（50 μg·mL?1）、中（100 μg·mL?1）、高（200 μg·mL?1）劑量組H1299細胞內MDA含量出現極顯著或極其顯著（P<0.01或P<0.001）的下降，SOD、GSH-Px和CAT活性均有不同程度升高（P<0.05，P>0.05或P<0.01），這一結果表明沙棘花青素提取物能夠降低細胞脂質過氧化損傷，并且能夠改善雙氧水對H1299細胞內SOD的抑制作用，提高受雙氧水損傷的H1299細胞內SOD、GSH-Px和CAT活性，表現出較強的抗氧化活性。

注：*表示與空白組對比差異顯著（P<0.05）；***表示與空白組對比差異極其顯著（P<0.001）；#表示與模型組對比差異顯著（P<0.05）；##表示與模型組對比差異極顯著（P<0.01）；###表示與模型組對比差異極其顯著（P<0.001）。

2.6 HRAE對雙氧水誘導的H1299細胞中ROS的影響

由圖5可知，與正常組相比，模型組H1299細胞ROS含量會明顯升高；與H2O2組比較，HRAE 50 μg·mL?1組、100 μg·mL?1組、200 μg·mL?1組H1299細胞內ROS明顯下降，并且呈現一定的劑量依賴，ROS和脂質過氧化物MDA含量能夠反映細胞內氧化應激的損傷程度，結合2.5中MDA的實驗結果可以看出，沙棘花青素提取物能夠明顯降低雙氧水誘導的細胞脂質過氧化損傷，并從而達到對細胞氧化損傷的保護作用。

圖5 HREA對H2O2誘導H1299細胞活性氧水平的影響（100×）Fig.5 Effect of HREA on ROS expressions in H2O2-exposed H1299 cells (100×)

2.7 Western Blot法檢測氧化應激相關蛋白表達水平

為了探討HRAE保護H1299細胞氧化損傷作用的機制，實驗采用Western Blot法檢測Nrf2、HO-1和KEAP1等蛋白的表達情況，見圖6。給予雙氧水損傷后，Nrf2、HO-1和KEAP1等蛋白的表達均呈現下降趨勢，給予不同濃度的HRAE后，均呈一定的上升趨勢。HO-1是Nrf2的下游基因，氧化應激狀態下Nrf2被激活，入核后啟動HO-1的轉錄表達，HO-1表達量增加從而催化降解血紅素、一氧化碳等，抑制氧化應激損傷[23]。過氧化物酶體增殖子活化受體（PPARγ）與Nrf2啟動子結合促進Nrf2表達[24]，高濃度沙棘花青素可激活PPARγ，從而促進Nrf2表達。p44/42 MAPK參與細胞增值、凋亡的生長過程，并且其激活程度與Nrf2表達相關。綜合上述結果可以看出，HRAE對雙氧水誘導的H1299細胞氧化損傷具有顯著的保護作用，保護機制可能與通過上調PPARγ、Nrf2、HO-1、KEAP1和p44/42 MAPK的表達從而激活Nrf2/HO-1信號通路有關，并且在高濃度（200 μg·mL?1）時保護作用尤為明顯。

圖6 HREA對H2O2誘導H1299細胞Nrf2、HO-1、PPARγ、p44/42 MAPK和KEAP1蛋白的影響Fig.6 Effects of HREA on Nrf2, HO-1, PPARγ, p44/42 MAPK and KEAP1 protein expressions in H2O2-exposed H1299 cells

2.8 沙棘花青素提取物“有效成分-疾病”靶點的分子對接結果

根據文獻報道，沙棘花青素中主要組成成分為表兒茶素和兒茶素[12]。分子對接結果顯示，沙棘花青素提取物中的表兒茶素和兒茶素2個關鍵活性成分[12]與氧化應激相關蛋白靶點以及Nrf2/HO-1通路的關鍵蛋白靶點Nrf2（Q9Z2X8）均具有良好的自由結合活性，結合能分別為?7.81和?6.80 kJ·mol?1，表明表兒茶素和兒茶素可能是沙棘花青素提取物抗氧化應激的潛在藥效物質。結合能小于0 kJ·mol?1表明成分與靶點可以自由結合，結合能小于?5 kJ·mol?1則表明活性成分與靶點具有良好的結合能力，并且結合能越低越好[25]。其中，表兒茶素與潛在靶點的對接得分更小，說明其與受體蛋白的結合能力更強，為最關鍵活性成分。從價鍵角度看，表兒茶素可以與Nrf2蛋白殘基ALA-466、VAL-604、LEU-557和GLY-367通過氫鍵相連；兒茶素可以與Nrf2蛋白殘基ALA-466、VAL-606、ILE-559、VAL-514和GLY-367通過氫鍵相連，從而形成穩定的對接模式，本文選擇結合能最低的構象對接結果進行2D可視化展示（見圖7），結果表明它們均能與受體蛋白形成穩定構象，且具有較高的結合穩定性，這為以表兒茶素和兒茶素為主要活性成分的沙棘花青素提取物通過干預 Nrf2/HO-1通路的關鍵靶點Nrf2受體抗氧化應激提供了理論基礎，并且與上述實驗研究相呼應。

圖7 沙棘花青素提取物與受體蛋白的對接模式圖和2D展示圖Fig.7 Docked pattern and 2D display of anthocyanin extracts from seabuckthorn and receptor proteins

3 討論與結論

沙棘花青素提取物干預能顯著提高肺細胞的細胞活力（P<0.05或P<0.01），細胞中ROS和MDA等含量也顯著降低（P<0.01或P<0.001），提高SOD、CAT的活性（P<0.05或P<0.01），表明沙棘花青素提取物對人非小細胞肺癌H1299細胞具有保護作用。有研究表明，人體在攝入大量含有花青素食物后，能夠產生一定抗氧化作用，從而保護組織器官，例如葡萄籽花青素（LGSP）具有明顯的抗炎作用，研究人員通過RAW 264.7細胞和斑馬魚實驗得到證實，其作用機制可能與抑制MAPK和NF-кB信號通路的激活，從而對RAW 264.7細胞中NO和促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的產生具有較強的抑制作用，達到抗炎的療效[26]。另有研究表明花青素具有顯著保護肺部器官的作用[27]，魏猛等[28]從細胞水平研究了原花青素對肺部氧化損傷的保護作用，該研究采用人支氣管上皮細胞，以砷進行氧化損傷誘導，對MDA、ROS等相關氧化應激指標進行檢測分析，該研究認為葡萄籽原花青素能夠有效拮抗砷誘導的肺部氧化損傷，為花青素對肺部氧化損傷的保護作用研究奠定了基礎。

由雙氧水誘導的細胞氧化損傷，除沙棘花青素提取物直接清除ROS外，還可能通過調節細胞中相關蛋白的表達，如HO-1、KEAP1和GST等。這些蛋白增強了組織和細胞間抗氧化能力，保護細胞抵御氧化脅迫，從而減輕了過多自由基引起的相關病癥。Nrf2-ARE與機體抗氧化系統具有密切的關系，正常情況下，細胞內的Nrf2與KEAP1相互綁定而靜止于細胞質內[29?30]。當細胞受到外界氧化脅迫后，Nrf2將會從KEAP1上解偶聯，轉移到細胞核內并與核內特定DNA序列結合，啟動相關保護酶基因消除由于氧化脅迫給機體帶來的損傷[31]。Nrf2是內生性抗氧化酶合成的關鍵因子。在正常生理狀態下，Nrf2與KEAP1在細胞質中處于結合狀態，能夠被蛋白酶降解而消失，當組織器官受到外界刺激，如組織過氧化損傷等，此時Nrf2與KEAP1解離，Nrf2與ARE在核內結合，從而使下游因子HO-1、KEAP1等表達，啟動相關保護酶基因消除由于氧化脅迫給機體帶來的損傷[23,32]。現已有報道稱，在肺組織氧化損傷中Nrf2信號通路起著重要作用，該通路通過誘導人肺上皮細胞HO-1和NQO1的表達，對肺組織氧化損傷起到保護作用[33?34]。過氧化物酶體增殖子活化受體（PPARγ）與Nrf2啟動子結合促進Nrf2表達[24]。ERK（p44/42 MAPK）參與細胞增值、凋亡的生長過程，并且有研究表明ERK（p44/42 MAPK）的激活程度和時間長短與Nrf2表達相關[35]，本研究Western Blot的蛋白表達結果也證實了這一點。

沙棘花青素提取物能夠顯著上調HO-1、KEAP1和Nrf2的蛋白表達水平，從而激活Nrf2/HO-1通路，對肺組織細胞氧化損傷具有保護作用。綜上所述，HRAE以濃度依賴降低雙氧水導致的H1299細胞氧化損傷，其機制可能與Nrf2/HO-1信號通路的激活有關。