不同養殖模式克氏原螯蝦肉中揮發性成分的差異研究

屠曉航，李鵬鵬，卞 歡，耿志明，諸永志，徐為民,3,，王道營,3,

（1.江蘇省農業科學院農產品加工所，江蘇 南京 210014；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；3.農業農村部農產品冷鏈物流技術重點實驗室，江蘇 南京 210014）

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）俗稱小龍蝦，屬節肢動物門、甲殼綱、十足目、螯蝦科，是我國重要的淡水經濟蝦類[1]?？耸显r營養豐富，膽固醇含量低，富含賴氨酸、谷氨酸、丙氨酸等多種氨基酸，以及平衡的脂肪酸組成和多種揮發性物質[2-3]。截至2022年，我國克氏原螯蝦養殖面積達1.87 km2、產量289.07 萬t，同比分別增長7.69%和9.76%，養殖產量首次超過鯽魚和鯉魚，產業綜合產值達到4 580 億元[4]。揮發性物質能客觀地反映食品的風味特點，是評價食品品質的重要指標，也是被消費者接受的主要因素之一[5]。國內外對克氏原螯蝦的研究主要集中在養殖模式、營養價值、副產物利用[6]等方面，但對于其揮發性成分，尤其是不同養殖模式蝦肉中揮發性成分的報道較少。徐文思等[7]在小龍蝦水煮液中共檢出73 種揮發性物質，包括醛類、烴類、酯類等，這些物質對小龍蝦水煮液風味起重要作用。Lee等[8]采用氣相色譜-嗅聞（gas chromatography-olfactometry，GC-O）技術在熟制美洲龍蝦尾肉中檢出47 種揮發性物質，其中，2-甲基丁醛、3-辛烯-2-酮、1-(甲硫基)丙醛等8 種揮發性物質對美洲龍蝦的風味做出的貢獻較大。何珊等[9]在研究新鮮南、北方地區中華絨螯蟹中揮發性物質的差異時，均檢出醇類、醛類和碳氫類等揮發性物質，其中乙酸乙酯、1-戊烯-3-醇等物質差異可能是造成兩地中華絨螯蟹風味不同的原因。目前，對克氏原螯蝦的揮發性風味成分品質的分析報道較少，共養模式對克氏原螯蝦風味品質的影響機制也有待研究。

克氏原螯蝦的養殖模式多樣，主要有稻田養殖、蟹塘養殖、藕塘養殖、池塘主養，其他還有茭白田、泥鰍池、水泥池、大棚精養等養殖模式，稻田養殖是其中的主要模式[10-11]。Xu Qiang等[12]采用生命周期評價方法評估了3 種養殖模式（即單一水稻栽培、蝦單一養殖和稻蝦共養）對環境影響，研究認為稻蝦共養模式可以更低的環境成本提供更多的營養，同時還能提高農民的經濟收入。蟹蝦、藕蝦養殖模式充分利用河蟹第3次蛻殼到第4次蛻殼之間和蓮藕葉莖出水后到藕收獲之間的間歇開展養殖，在保證主養品種河蟹、藕產量基本不變的前提下，可多收獲一定量的小龍蝦，從而提高總經濟效益[13]。由于地理位置、養殖模式、生產方式等不同，食品中揮發性物質、營養價值可能存在差異，如Kalogiouri等[14]通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技術結合層次聚類分析、主成分分析（principal component analysis，PCA），利用稀疏偏最小二乘判別分析建立穩健的分類模型，成功區分常規和有機養殖核桃油。因此，研究不同養殖模式克氏原螯蝦肉的揮發性成分，不僅可以為養殖戶對克氏原螯蝦養殖模式的選擇提供一定參考，也可以為消費者對克氏原螯蝦的選擇提供思路。本研究采用HS-SPME-GC-MS對4 種養殖模式克氏原螯蝦肉揮發性成分進行定量分析，并采用PCA和聚類分析法進行綜合評價，探討不同養殖模式之間克氏原螯蝦肉揮發性風味成分差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

克氏原螯蝦于2022年8月18日在江蘇省興化市取樣，不同養殖模式各選取10 尾（25.00±5.00）g鮮活克氏原螯蝦，去殼、取肉后用液氮速凍并于-80 ℃冰箱內貯藏。1 周內完成不同貯藏模式克氏原螯蝦HS-SPME-GC-MS檢測和分析，樣品信息見表1。

表1 不同養殖模式克氏原螯蝦樣品信息Table 1 Information on Procambarus clarkiisamples from different culture modes

1.2 儀器與設備

手動SPME進樣器（50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維頭） 美國Supelco公司；TSQ8000EVO GC-MS儀美國Thermo Fisher公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 江蘇國華電器有限公司；電熱鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；頂空采樣瓶 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

樣品處理：取出樣品在4 ℃條件解凍，分別稱取3.00 g克氏原螯蝦肉于頂空瓶中，每種養殖模式蝦肉各取樣3 次，加入10 μL 0.05 μg/μL 2-甲基-3庚酮（內標物），密封后，用渦旋儀混勻，60 ℃加熱，將肉熟化60 min后，獲取頂空成分。

1.3.2 HS-SPME-GC-MS測定揮發性物質

參照韓偉等[15]的方法進行測定。使用前，將萃取頭在GC儀進樣口處老化1 h。用固相微萃取頭在58 ℃條件下頂空吸附50 min，然后分析揮發性化合物。

1.4 數據處理

定性分析：將Xcalibur工作站與NIST 17質譜庫標準質譜圖對比，將峰高高于底峰3 倍且匹配度最高的成分作為鑒定結果。

定量分析：利用NIST譜圖庫自動結合手動積分得到的峰面積，根據內標物的添加量，求得各揮發性化合物在克氏原螯蝦肉中含量。

通過SPSS 21.0統計軟件對6 組養殖模式克氏原螯蝦肉中的揮發性成分及其含量進行PCA及聚類分析。

2 結果與分析

2.1 龍蝦肉中揮發性成分種類和含量分析

由表2、3可知，6 組養殖模式克氏原螯蝦中共檢出31 種揮發性成分，包括8 種酮類、3 種酯類、13 種烴類、3 種胺類、2 種醇類、2 種其他物質。DX1、DX2、DX3、XX1、XX2和OX養殖模式分別檢出20、20、19、24、18、21 種。

表2 不同養殖克氏原螯蝦揮發性成分及含量Table 2 Volatile components and contents of different cultured Procambarus clarkia ng/g

表3 不同養殖模式克氏原螯蝦揮發性成分分類比較Table 3 Comparison of the composition of volatile components of Procambarus clarkii in different culture modes

酮類是食品中一類重要的揮發性物質，通常閾值較低，對食品的風味有一定貢獻[16]。酮類揮發物通常來源于脂質氧化、烷烴降解和美拉德反應[17]。2-壬酮常被認為是甲殼類水產養殖產品中的有利揮發性風味物質，具有濃郁的果香且閾值較低[18]，可能是克氏原螯蝦肉中關鍵風味物質。由表2～3可知，酮類物質在6 組養殖模式克氏原螯蝦肉中揮發性物質的種類和含量都存在顯著差異（P＜0.05），DX1、DX2、DX3、XX1、XX2、OX養殖模式的克氏原螯蝦肉中的種類和含量分別為6（17.56 ng/g）、5（14.73 ng/g）、6（16.35 ng/g）、7（17.45 ng/g）、4 種（7.17 ng/g）和8 種（17.66 ng/g）。3-庚酮、4-辛酮、2,4-二甲基-3-庚酮、5-壬酮是6 組養殖模式克氏原螯蝦肉中的共有揮發性酮類物質，而3,5-二甲基-2-辛酮僅在DX3、XX1、OX養殖模式的克氏原螯蝦肉中存在，且含量較高，可能是造成不同養殖模式克氏原螯蝦風味不同的原因。

酯類物質通常是由脂肪或蛋白質降解引起的醇和酸之間的酯化反應產生，或來自乙醇中甘油三酯、脂肪酸和酯之間的醇解反應，通常具有花香和果香，可減弱脂肪酸的刺激性氣味和苦味氨基酸的風味，酯類化合物閾值較低，通常對食品風味的貢獻較大[19-20]。在本研究6 組養殖模式中，除DX2（0.11 ng/g）和DX3（0.05 ng/g）外，DX1、XX1、XX2、OX養殖模式的克氏原螯蝦肉中揮發性物質含量相差不大，分別為0.18、0.17、0.19、0.19 ng/g。十六烷酸甲酯是唯一一種在6 組養殖模式克氏原螯蝦肉中均存在的揮發性物質。

31 種揮發性化合物中烴類物質種類最多，DX1、DX2、DX3、XX1、XX2、OX養殖模式克氏原螯蝦肉中揮發性物質分別為8、9、8、12、8、7 種，含量分別為15.65、11.80、4.74、10.31、10.54、8.87 ng/g。烴類通常是由脂肪酸烷氧自由基均裂產生，其閾值較高，對食品風味貢獻較小[21]。烯烴類物質通過加成、縮合等反應可以形成酮類和醇類，是克氏原螯蝦產生腥味的潛在因素[22]。但王惠惠等[23]認為此類物質可作為醛類、酮類的前體物質，有助于促進肉產品風味的形成。1-甲基-3-(1-甲基乙基)苯、十四烷僅在XX1養殖模式中檢測到，這可能是引起XX1與其他模式克氏原螯蝦肉風味不同的原因。除1,1,3,3-四乙氧基丙烷僅在DX3養殖模式檢測到外，其他烴類物質的種類差異較小，僅在含量方面表現較大差異。

醇類物質主要來源于脂肪氧化、氨基酸還原和碳水化合物的代謝[24]。部分醇類具有花香和果香，主要由相應醛的還原產生，僅在含量高時才被感知，對食品風味貢獻較小[25]。朱青云等[26]研究青海牦牛肉的揮發性風味品質時，認為醇類閾值較高，對青海牦牛肉的揮發性風味品質貢獻不大。除DX2養殖模式，醇類在其余5 種養殖模式小龍蝦肉中的揮發性物質含量差異不顯著，且僅在DX2養殖模式的克氏原螯蝦肉中檢出2 種醇類化合物，其含量為2.33 ng/g；DX1、DX3、XX1、XX2養殖模式的克氏原螯蝦肉中均含有1 種揮發性物質，而OX養殖模式的克氏原螯蝦肉中未檢出醇類物質。

檢出的揮發性化合物中胺類物質占比較小，總量為0.56～0.88 ng/g。6 組養殖模式中除OX養殖模式的克氏原螯蝦外（3 種），其他養殖模式的克氏原螯蝦肉中都含有2 種胺類物質。

2.2 確定主成分

主成分碎石圖曲線的陡峭程度可以反映各成分的變化趨勢，進而明確主成分的提取數量[27]。一般來說，高質量PCA模型中前2 個PC的累計貢獻率應在60%以上[28]。由圖1可知，前3 個PC的特征值呈快速下降趨勢，且從第4個PC特征值開始，碎石圖曲線趨于平緩。由表4可知，3 個PC的特征值分別為14.81、7.17、2.98，均大于1，累計貢獻率為96.01%，能夠準確反映6 組養殖模式克氏原螯蝦肉揮發性風味的整體狀況。因此，選取前3 個P C 作為本研究中6 組養殖模式克氏原螯蝦肉中揮發性成分評價的分析指標。

表4 不同養殖模式克氏原螯蝦主成分結果Table 4 Eigenvalues and contribution rates of principal components for Procambarus clarkii in different culture modes

2.3 不同養殖模式的克氏原螯蝦肉揮發性成分的PCA差異

PCA作為一種多元統計分析技術被廣泛用于樣本變異分析，能夠簡化數據并揭示不同樣本之間的相互關系，這種分析涉及描述樣本之間的無監督分類趨勢[29-30]。PCA首先對得到的數據進行標準化處理，進而便于對6 組樣品間的相似性和差異性進行科學準確評價。Gewers[31]、羅楊[32]等認為PCA中樣品之間距離近則代表差異小，距離遠則代表差異明顯。如圖2所示，各組樣品均被分開且無任何重疊，表明各組樣品在揮發性成分上皆存在差異，通過PCA分析，6 組養殖模式的克氏原螯蝦肉中的揮發性成分得到較好的區分，且重復性較好。

圖2 不同養殖模式的克氏原螯蝦肉揮發性成分的PCA得分圖Fig. 2 PCA score plot of volatile components of Procambarus clarkii meat from different farming modes

2.4 不同養殖模式的克氏原螯蝦肉中揮發性成分的綜合評價

以3 個PC為初始自變量，經PCA計算因子得分，再根據因子得分系數矩陣和每個PC的特征值得出克氏原螯蝦肉中揮發性成分前3 個PC線性關系分別為：

式中：X1～X31代表不同養殖模式克氏原螯蝦肉中所檢出的31 種揮發性成分。

根據所提取PC對應的方差相對貢獻率作為權重，對3 個PC得分進行權重加和，建立綜合評價函數F＝0.569F1+0.278F2+0.115F3，計算各組綜合得分，分值越高表明克氏原螯蝦的揮發性風味成分品質越好。如表5所示，6 組養殖模克氏原螯蝦肉中DX1養殖模式的得分最高，揮發性風味品質最好，其后依次為DX2、XX2、XX1、DX3、OX。

表5 不同養殖模式克氏原螯蝦PCA和綜合得分Table 5 PCA and comprehensive scores of Procambarus clarkii in different culture modes

2.5 聚類分析結果

分層聚類是聚類過程中常用的方法，期取代聚類樣本中個體與距離的關系，并將距離相近的樣本歸入一類，重復此過程以完成聚類[33]。如圖3所示，6 組克氏原螯蝦養殖模式分為5 類，DX1、DX2、DX3、XX1養殖模式為一類，XX2和OX養殖模式為一類。DX1養殖模式克氏原螯蝦肉中酮類物質、烴類物質含量較高，品質最好；DX2養殖模式的克氏原螯蝦品質較好，腥味胺類物質含量最低；DX3品質較差。揮發性物質可分為4 類，酮類單獨為一類，酮類閾值較低，含量較高與其他揮發性物質的相關性較強；酯類與胺類物質聚為一類；醇類單獨為一類；烴類和其他聚為一類，二者閾值較高，但與其他物質相關性較強。聚類分析與PCA結果較為相似，可以較為準確體現6 組養殖模式克氏原螯蝦肉的揮發性風味成分品質差異。

圖3 不同養殖模式克氏原螯蝦的揮發性成分的聚類分析熱圖Fig. 3 Heatmap of cluster analysis of volatile components of Procambarus clarkii from different culture modes

3 結 論

通過HS-SPME-GC-MS技術檢測分析江蘇省興化地區不同養殖模式克氏原螯蝦肉中的揮發性物質，共檢出31 種揮發性物質，包括8 種酮類、3 種酯類、13 種烴類、3 種胺類、2 種醇類、2 種其他，其中揮發性物質含量最多的是DX1（34.69 ng/g）。主要呈味物質酮類和酯類的總含量在OX養殖模式中最高（17.85 ng/g），在XX2模式中含量最低（7.36 ng/g）。利用PCA建立綜合評價模型，結果表明，DX1養殖模式揮發性風味成分品質最好，OX養殖模式的克氏原螯蝦肉揮發性風味成分品質較差。聚類分析將不同養殖模式分為5 類，揮發性物質分為4 類，與PCA結果結合較好地體現了不同養殖模式的克氏原螯蝦肉揮發性風味品質的差異性。綜上所述，一稻兩蝦養殖模式的克氏原螯蝦揮發性風味品質最好，藕蝦養殖模式較差。本研究為建立優質克氏原螯蝦的養殖模式提供一定的基礎；此外，為建立優質克氏原螯蝦的養殖模式提供更全面的指導，還需要結合克氏原螯蝦肉的其他品質性質進行綜合分析。