細胞周期素D1對HBV轉錄和復制的影響

彭思雯， 關貴文， 張 婷， 魯鳳民， 劉 佳， 陳香梅

北京大學基礎醫學院 病原生物學系暨感染病研究中心， 北京 100191

HBV感染是全球重要公共衛生問題之一[1-2]。但由于對HBV生命周期的認識還不夠充分，目前尚缺乏有效治愈慢性乙型肝炎(CHB)的藥物。因此，深入解析HBV復制的調控機制，將為抗HBV新藥物研發提供有效靶點。

HBV屬嗜肝DNA病毒科病毒，基因組為部分雙鏈的松弛環狀DNA(relaxed circular DNA, rcDNA)，其復制過程有著獨特的逆轉錄步驟[3]。研究[4-5]表明，HBV的復制依賴于肝細胞的細胞周期。例如，HBV在靜止肝細胞中的復制更為活躍，而在細胞開始分裂時復制減慢。細胞周期素D1(cyclin D1，基因名CCND1)是細胞周期進程的正性調節因子，可通過結合并激活細胞周期素依賴性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)4、6，促進細胞由靜止期(G0)或間期1(G1)進入DNA合成期(S)。研究[6-7]發現，cyclin D1在包括肝癌在內的多種腫瘤組織中呈異常高表達，但cyclin D1是否影響HBV復制目前尚未見報道。本研究通過挖掘公共數據庫數據以及應用HBV復制細胞模型，探究cyclin D1對HBV復制的影響，并對其調控HBV復制的可能機制進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞系HepG2購自美國ATCC數據庫，Huh-7細胞購自上海中科院細胞庫。pFLEX-cyclin D1-T286A、pGL3-HBV BCP、Actin-Renilla和pGL3-basic質粒為本室前期保存構建。prcccDNA/pCMV-Cre重組質粒系統由prcccDNA質粒和pCMV-Cre表達質粒組成[8]，為復旦大學基礎醫學院鄧強教授惠贈。

1.2 細胞培養與轉染 HepG2和Huh-7細胞均采用含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、鏈霉素的DMEM培養基，在37 ℃和含5% CO2的細胞培養箱中常規培養。細胞轉染前1天，將生長狀態良好的細胞按1.5×105個/孔接種至12孔板，其中HepG2細胞接種前需鋪好鼠尾膠原。按照LipofectamineTM2000(購自美國Invitrogen公司)說明書進行質粒轉染，6 h后更換新鮮培養基繼續培養，72 h后收集培養上清及細胞沉淀用于后續實驗研究。

1.3 質粒構建 采用同源重組的方法構建pCMV-cyclin D1表達質粒，其中擴增cyclin D1編碼區的引物序列為：上游5′-ATTGTACCCGCGGGCCATGGAACACCAGCTCCTGTGC-3′，下游5′-GGATCCCCGCGGCCGCGTCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAATC-3′。cyclin D1持續激活突變體表達質粒pCMV-cyclin D1-T286A是在pFLEX-cyclin D1-T286A質?；A上，采用雙酶切連接的方法構建而成。上述質粒DNA的序列均經測序驗證[測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成]。

1.4 HBsAg和HBeAg檢測 使用時間分辨免疫熒光法檢測細胞培養上清中HBsAg和HBeAg，檢測試劑盒購自蘇州新波生物技術公司。所用檢測設備為SYM-BIO Anytest時間分辨熒光分析儀(上海新波生物技術有限公司)。

1.5 HBV DNA定量檢測 細胞培養上清用3000 r/min離心3 min，吸取200 μL上清首先進行95 ℃加熱10 min，使病毒蛋白變性，然后使用Light Cycle 480Ⅱ實時熒光定量PCR儀和羅氏2×SYBR Green Mix進行HBV DNA相對定量檢測。上游引物序列為5′-CGGCGTTTTATCATMTTCCTCT-3′，下游引物序列為5′-GACAAACGGGCAACATACCTT-3′。

1.6 反轉錄-實時熒光定量PCR(RT-qPCR)實驗 Trizol法提取細胞總RNA，采用Roche反轉錄試劑盒(購自美國羅氏公司)逆轉錄為cDNA。取2 μL cDNA為模板，使用2×SYBR Green Mix(購自美國羅氏公司)進行實時熒光定量PCR檢測細胞內HBV mRNA表達水平，以管家基因ACTIN作為內參。HBV RNA檢測所用引物序列如下：3.5 kb HBV RNA上游引物為5′-AGACCACCAAATGCCCCTATC-3′，下游引物為5′-TCTGCGAGGCGAGGGAGTTC-3′，可檢測pgRNA和preC mRNA兩種RNA；preC mRNA上游引物為5′-TCTGCGCACCAGCACCATG-3′，下游引物為5′-CAATGCTCAGGAGACTCTAAGGC-3′。宿主基因APOBEC3G上游引物為5′-GCATCGTGACCAGGAGTATGA-3′，下游引物為5′-GTCAGGGTAACCTTCGGGT-3′；?；悄懰徕c共轉運多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP)上游引物為5′-AAGGACAAGGTGCCCTATAAAGG-3′，下游引物為5′-TTGAGGACGATCCCTATGGTG-3′；肝細胞核因子1α(hepatocyte nuclear factor 1α, HNF1α)上游引物為5′-AACACCTCAACAAGGGCACTC-3′，下游引物為5′-CCCCACTTGAAACGGTTCCT-3′；染色體結構維持復合物5(structural maintenance of chromosome 5, SMC5)上游引物為5′-TCCCGAGAGACCCTTCGTC-3′，下游引物為5′-TTCCATTGGCTCCAACGATCA-3′；叉頭盒轉錄基因M1(forkhead box M1, FOXM1)上游引物為5′-ATACGTGGATTGAGGACCACT-3′，下游引物為5′-TCCAATGTCAAGTAGCGGTTG-3′；ACTIN的上游引物為5′-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3′，下游引物為5′-ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG-3′。

1.7 Western blot實驗 收集細胞沉淀，加入約細胞體積3倍的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，12 000×g、4 ℃離心10 min后取上清，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳分離蛋白后轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉60 min，按各抗體說明書使用量稀釋后加入適量一抗4 ℃搖床雜交過夜，加入二抗(二抗原液按1∶8000稀釋)室溫孵育2 h。使用Odyssey雙色紅外激光成像系統(美國LICOR公司)和Odyssey V1.2軟件進行雜交膜的掃描和分析。

1.8 雙熒光素酶活性檢測 為了確定cyclin D1對HBV基本核心啟動子(BCP)活性的影響，將帶有HBV BCP區的pGL3熒光素酶報告載體(pGL3-HBV BCP)與pCMV-cyclin D1或pCMV-cyclin D1-T286A共轉染HepG2細胞，同時共轉Actin-Renilla質粒作為內參對照。轉染48 h后，使用Dual Luciferase Reporter Assay試劑盒中的Passive Lysis Buffer裂解細胞，吸取25 μL上清檢測螢火蟲和海腎螢光素酶活性，以螢火蟲/海腎的比值表示報告基因的活性。所用設備為多功能酶標儀(PerkinElmer公司)。

1.9 數據下載與分析 在GEO數據庫(Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載轉錄組數據集GSE84044和GSE83148[9-10]。GSE84044收錄了124例HBV相關肝纖維化患者肝組織的轉錄組數據，GSE83148收錄了122例CHB患者肝組織的轉錄組數據。通過limma包[11]，對下載的數據進行了歸一化處理。在分析與HBV DNA相關的宿主基因時，選擇了GSE84044數據集中性別為男性且血清HBV DNA載量大于104拷貝/mL的患者共計59例。

1.10 統計學方法 采用GraphPad Prism V5.0、R(v4.1.3)[12]及SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析。正態分布的計量資料兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態分布的計量資料兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。相關性分析時采用Spearman秩相關，錯誤發現率(false discovery rate, FDR)<0.05且|r|>0.3被定義為顯著相關基因。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝組織CCND1表達水平與血清HBV DNA載量呈負相關 通過分析GSE84044數據集中59例男性HBV相關肝纖維化患者肝組織的轉錄組數據，共找到了765個表達水平與患者血清HBV DNA水平顯著相關的宿主基因(FDR<0.05，|r|>0.3，圖1a)。通過與116個細胞周期基因(ko04110)取交集，發現其中有7個基因為細胞周期相關基因，且這7個基因在肝臟中的表達水平均與血清HBV DNA水平呈顯著負相關(FDR<0.05，r值均<-0.3，P值均<0.05)(圖1a、1b)，按相關性由強到弱排序依次為MYC、TGFB1、CCND1、YWHAZ、HDAC1、YWHAB和E2F3。其中，CCND1是調控細胞從G0/G1期向S期轉換的關鍵因子，其表達水平與HBV DNA載量呈顯著負相關(r=-0.474，P<0.001)(圖1c)。

注：a，GSE84044數據集中與患者HBV DNA載量相關的肝組織宿主基因，樣本按照HBV DNA載量的高低從左到右排列，藍色代表低表達，紅色代表高表達；b，765個與HBV DNA載量顯著相關基因和116個細胞周期基因的交集；c，肝組織中CCND1水平與血清HBV DNA載量之間的相關性分析。

2.2 外源表達cyclin D1抑制HBV復制 為探究cyclin D1蛋白對HBV復制的影響，構建了pCMV-cyclin D1和pCMV-cyclin D1-T286A表達質粒，并將上述質粒分別與prcccDNA/pCMV-Cre質粒體系共同轉染至HepG2及Huh-7細胞中，72 h后收集細胞沉淀和細胞培養上清液。Western blot實驗證實pCMV-cyclin D1和pCMV-cyclin D1-T286A表達質粒均可在兩種細胞中成功表達，且cyclin D1和cyclin D1(T286A)過表達均能顯著降低細胞內HBV core蛋白水平(圖2a、2b)。與此結果一致，過表達cyclin D1和cyclin D1(T286A)亦顯著下調了兩種細胞上清液中的HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平(圖 2c、d)。

注：a、b，外源表達cyclin D1降低HepG2和Huh-7細胞HBV core蛋白的水平；c、d，外源表達cyclin D1下調HepG2和Huh-7細胞培養上清液中的HBsAg、HBeAg與HBV DNA水平。

2.3 外源表達cyclin D1在轉錄水平抑制HBV復制 為了探究cyclin D1蛋白抑制HBV復制的可能環節，采用RT-qPCR方法，在HepG2細胞中檢測了cyclin D1和cyclin D1(T286A)對HBV RNA水平的影響。結果顯示，過表達cyclin D1和cyclin D1(T286A)均可顯著抑制HepG2細胞中HBV的3.5 kb mRNA及preC mRNA水平(圖3a)。與此一致，雙熒光素酶報告基因實驗證實，過表達cyclin D1和cyclin D1(T286A)均顯著抑制了HBV BCP啟動子活性(圖3b)。

注：a，RT-qPCR檢測cyclin D1和cyclin D1(T286A)過表達對HepG2細胞內HBV RNA的影響；b，雙熒光素酶報告基因實驗檢測過表達cyclin D1和 cyclin D1(T286A)對HBV BCP啟動子活性的影響。

2.4 cyclin D1通過下調HNF1α和NTCP表達抑制HBV復制 為了進一步探究cyclin D1抑制HBV復制的可能機制，利用GSE83148數據集中122例CHB患者的肝臟轉錄組數據，分析了CCND1與10個已報道調控HBV復制的重要宿主基因的相關性(圖4a)。結果顯示，CCND1水平與抑制HBV復制的APOBEC3G(r=0.575，P<0.001)、SMC5(r=0.341，P<0.001)和FOXM1(r=0.333，P<0.001)表達呈顯著正相關，而與HBV進入受體NTCP(r=-0.511，P<0.001)和HBV復制正向調控轉錄因子HNF1α(r=-0.430，P<0.001)表達呈顯著負相關。采用RT-qPCR方法，對與CCND1表達相關性較高的APOBEC3G、NTCP、HNF1α、SMC5和FOXM1進行了定量分析。結果顯示，在HepG2細胞中過表達cyclin D1降低了HNF1α(P<0.001)和NTCP(P<0.01)的 RNA水平，同時也抑制APOBEC3G和SMC5表達(圖4b)。

注：a，CHB肝組織中CCND1與多個HBV調控基因的表達相關矩陣；b，RT-qPCR方法檢測cyclin D1對HepG2細胞內APOBEC3G、NTCP、HNF1α、SMC5和FOXM1表達的影響。

3 討論

病毒需要依附活細胞才能完成其生命周期，故病毒與宿主細胞之間存在大量互作調控。已有研究[4]報道，HBV復制依賴于細胞周期，肝細胞的快速增殖可以抑制HBV復制，但其機制尚未闡明。本研究發現細胞周期調控關鍵蛋白cyclin D1可以抑制HBV復制，機制上可能與cyclin D1抑制HNF1α和NTCP表達有關。

已有研究[4]發現，HBV感染能使原代肝細胞富集于G2/M期，同時促HBV復制的細胞轉錄因子如PPARA、RXRA和CEBPB等也在HBV感染時上調，表明HBV復制可能更易在增殖抑制的肝細胞中復制。在增殖旺盛的肝癌組織中，HBV cccDNA及HBV復制水平則顯著低于癌旁組織，進一步證實增殖的肝細胞不利于病毒復制[13]。與上述發現一致，本研究通過對GEO數據庫的肝臟轉錄組數據集分析發現，有7個細胞周期調控相關的基因表達與患者血清HBV DNA載量呈負相關，分別為MYC、TGFB1、CCND1、YWHAZ、HDAC1、YWHAB和E2F3。其中，已有文獻報道MYC[14]及TGFB1[15]可以通過不同機制抑制HBV的復制，這與本研究的分析結果相符合。HDAC抑制劑[5]如FK228/SAHA以及敲減HDAC1基因，均可通過上調p21誘導細胞發生G0/G1期阻滯，進而促進HBV復制。但CCND1、YWHAZ、YWHAB和E2F3是否影響HBV復制目前未見報道。

CCND1基因編碼的蛋白產物為cyclin D1。cyclin D1是調控細胞周期由G0/G1期向S期轉換的關鍵因子。cyclin D1可與CDK4/6形成復合物，進入細胞核內使RB蛋白磷酸化，并使后者失去對轉錄因子E2F的抑制，進而上調cyclin E、cyclin A的表達，從而啟動細胞向S期轉換。cyclin D1主要經泛素-蛋白酶體系降解，其出核主要由出核運輸蛋白CRM1介導[16]，CRM1與cyclin D1結合依賴于cyclin D1第286位蘇氨酸(T286)磷酸化[17]。當T286A突變導致該磷酸化基序丟失時，突變cyclin D1主要定位于細胞核內，可促進細胞異常增殖。本研究發現，表達外源cyclin D1及cyclin D1(T286A)突變體均能顯著抑制HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平，以及細胞內HBV RNA和HBV core蛋白水平，表明cyclin D1能抑制HBV復制。HBV BCP啟動子主要調控3.5 kb mRNA的轉錄，其中pgRNA既可作為mRNA翻譯合成病毒core蛋白和P蛋白，也可作為反轉錄的模板在核衣殼內合成rcDNA，而preC mRNA則主要翻譯外泌的HBeAg。本研究發現cyclin D1能顯著抑制BCP區的轉錄活性，提示cyclin D1可在轉錄水平抑制HBV復制。筆者團隊也注意到，cyclin D1及cyclin D1(T286A)突變體對HBV復制的抑制作用未見明顯不同，且二者對HepG2和Huh7細胞增殖的影響也不大，可能與本研究采用的HBV復制模型是增殖速度較快的肝癌細胞株有關，未來需要在原代肝細胞中加以驗證。

目前認為，細胞周期影響HBV復制的機制主要有3個方面：(1)抑制HBV進入肝細胞的功能性受體NTCP表達，從而抑制HBV的從頭感染[13,18]；(2)影響HBV復制調控分子的表達，如HNF4α、RXRA和CEBPB等[4]，從而抑制HBV基因的轉錄；(3)影響HBV的成熟和釋放[19-20]。本研究通過對數據分析發現，CHB患者肝組織中的CCND1與APOBEC3G、SMC5和FOXM1呈顯著正相關，而與NTCP和HNF1α呈顯著負相關。筆者團隊的前期研究[13]發現，cyclin D1可抑制NTCP表達，提示cyclin D1也能抑制HBV對肝細胞的從頭感染。HNF1α能夠調控cccDNA的大部分調控元件(包括preS1啟動子[21]、核心啟動子[22]和增強子Ⅱ[23])，在HNF1α缺失的情況下HBV復制能力顯著降低[24]。本研究進一步證實過表達cyclin D1能夠抑制HNF1α和NTCP的表達，提示cyclin D1抑制HBV復制可能與其對HNF1α和NTCP的調控有關。

綜上，本研究發現細胞周期關鍵蛋白cyclin D1可通過抑制HBV基因轉錄來抑制病毒復制，可為進一步闡明細胞周期調控HBV復制的分子機制提供理論依據，并為抗HBV新藥研發提供潛在的分子靶點。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：彭思雯、關貴文負責實驗，撰寫修改論文；張婷負責實驗和論文的撰寫及修改；魯鳳民、劉佳、陳香梅負責指導撰寫文章并最后定稿。鼓思雯與關貴文對本文貢獻等同，同為第一作者。