大黃靈仙方對(duì)膽固醇結(jié)石豚鼠模型膽囊Cajal間質(zhì)細(xì)胞中scf/c-kit信號(hào)通路的影響

肖麗君， 甘苡榕， 劉春麗， 李承積， 楊 文， 龐澆安， 滕金豪， 俞 淵

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 研究生學(xué)院， 南寧 530001； 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽外科， 南寧 530023

膽囊膽固醇結(jié)石(cholesterol gallstone，CG)是外科臨床上的常見病、多發(fā)病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，其在西方成年人群中的發(fā)病率為10%～15%[1]，在我國的發(fā)病率為4.42%～11%[2]。CG成因復(fù)雜，主要包括膽汁膽固醇過飽和、膽汁中促/抗成核因子平衡破壞、膽固醇單水結(jié)晶析出及膽囊動(dòng)力功能障礙等，其中膽囊動(dòng)力功能障礙是導(dǎo)致CG形成的關(guān)鍵因素[3]。目前已有大量研究表明，膽囊動(dòng)力下降、膽固醇結(jié)石形成均與Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal，ICC)及其內(nèi)部的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子/酪氨酸激酶受體(scf/c-kit)信號(hào)通路有關(guān)，彭雅亞等[4]研究發(fā)現(xiàn)CG發(fā)病過程中膽囊動(dòng)力學(xué)的減弱與ICC有一定關(guān)聯(lián)；趙健楠等[5]通過歸納總結(jié)大量文獻(xiàn)后亦發(fā)現(xiàn)ICC的丟失、起搏電位減弱及對(duì)膽囊收縮素反應(yīng)性降低等功能障礙均可能促進(jìn)CG形成，且其發(fā)生機(jī)制可能與scf/c-kit信號(hào)通路抑制有關(guān)；許金煌等[6]通過將不同質(zhì)量濃度的膽固醇培養(yǎng)液作用于體外分離培養(yǎng)的豚鼠膽囊ICC中，發(fā)現(xiàn)高濃度的膽固醇環(huán)境通過抑制scf/c-kit信號(hào)通路影響膽囊ICC的生長(zhǎng)發(fā)育，并促使其凋亡增加，進(jìn)而引起膽囊ICC總數(shù)量的減少，導(dǎo)致膽囊的自發(fā)節(jié)律收縮功能下降，從而在CG形成過程中發(fā)揮作用。

大黃靈仙方是唐乾利老師總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)制的治療膽石癥的有效復(fù)方，其團(tuán)隊(duì)也通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了大黃靈仙方的確切療效，如通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路抑制膽管細(xì)胞炎性反應(yīng)阻止膽石癥的發(fā)生[7]、通過調(diào)節(jié)膽管內(nèi)皮細(xì)胞TGFβ1mRNA、Smad2/3mRNA表達(dá)減少膽石癥的復(fù)發(fā)率[8]等。基于上述研究，筆者參考Feng等[9]的實(shí)驗(yàn)方法，通過高膽固醇濃度對(duì)膽囊ICC損傷模型的構(gòu)建，探討大黃靈仙方是否能通過調(diào)控膽囊ICC中scf/c-kit信號(hào)通路影響膽囊動(dòng)力功能，進(jìn)而達(dá)到減少CG發(fā)生及復(fù)發(fā)的目的。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用SPF級(jí)健康雄性豚鼠45只，體質(zhì)量219.7～290.4 g，購買于廣西廣得生物科技有限公司(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：scxk桂2017-0001；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：0009675)。所有豚鼠飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物房，動(dòng)物房溫度恒定18～24 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，豚鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品與試劑 大黃靈仙方組成：生大黃15 g、威靈仙30 g、芒硝10 g、金錢草30 g、枳殼12 g、雞內(nèi)金12 g、澤蘭15 g、柴胡12 g、郁金12 g、磁石10 g、黃芪30 g、炙甘草5 g，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科按相等劑量換算配為顆粒劑，所有中藥顆粒劑均由江陰天江藥業(yè)有限公司提供，均為同一批號(hào)；無水乙醇、二甲苯、正丁醇、3%雙氧水、中性樹膠(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)分別為100092683、10023418、100052190、10011208、10004160)；檸檬酸(pH=6.0)抗原修復(fù)液、PBS緩沖液、4%多聚甲醛、BSA、正常兔血清、蘇木素染液、蘇木素分化液、蘇木素返藍(lán)液、組化試劑盒DAB顯色劑(武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)分別為G1202、G0002、G1101、G5001、G1209、G1004、G1309、G1340、G1211)；細(xì)胞裂解液、甘氨酸、脫脂乳、TBST緩沖液(Solarbio公司，貨號(hào)分別為R0020、G8200.316y065、414W052、T1082)；5×蛋白上樣緩沖液(Biosharp公司，貨號(hào)Cat.No.TY-201-T20B/20210830)；ECL底物液(Beyotime公司，貨號(hào)P00185)。

1.3 儀器 PVDF膜(Sigma公司，型號(hào)ISEQ00010)；包埋機(jī)、凍臺(tái)(武漢俊杰電子有限公司，型號(hào)分別為JB-P5、JB-L5)；病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司，型號(hào)RM2016)；組織攤片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)KD-P)；烤箱(上海慧泰儀器制造有限公司，型號(hào)DHG-9140A)；免疫組化筆(武漢賽維爾生物科技有限公司，型號(hào)為WG1066-1)；移液槍(Dragon公司，型號(hào)KE0003087/KA0056573)；顯微鏡(Nikon公司，型號(hào)E100)；成像系統(tǒng)(日本尼康，型號(hào)Nikon DS-U3)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及造模 將45只豚鼠隨機(jī)分為3組，正常組、模型組、中藥組各15只，其中正常組予正常飼料喂養(yǎng)，模型組、中藥組予高脂致石飼料(由上海成大飼料有限公司提供，組成為：82.5%普通飼料+15%脂肪+2%膽固醇+0.5%膽酸)喂養(yǎng)，喂養(yǎng)8周后分別從各組中隨機(jī)抽取5只豚鼠，其中模型組、中藥組在肉眼觀察下結(jié)石形成超過4只，則判斷為模型建立成功。

2.2 給藥方法及劑量選擇 造模結(jié)束后開始灌胃給藥，中藥用量參照《中藥藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[10]按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體藥物等效劑量換算公式計(jì)算，豚鼠的給藥劑量為：X mg/kg×70 kg×0.031/400 g=X mg/kg×70 kg×0.031/0.4 kg=5.42 X mg/kg，最終確定大黃靈仙方給藥劑量為2 mL/100 g。中藥組予大黃靈仙方中藥灌胃，模型組予等體積生理鹽水灌胃，正常組不予特殊干預(yù)；每日給藥1次，連續(xù)灌胃給藥8周后對(duì)豚鼠膽囊進(jìn)行取材。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

2.3.1 HE染色檢測(cè)膽囊病理學(xué)改變 將蠟塊切成5 μm厚的切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水后，予蘇木精-伊紅(HE)染色，以中性樹膠進(jìn)行固定封片，進(jìn)行圖像采集，觀察膽囊組織的病理性改變。

2.3.2 免疫組化檢測(cè)膽囊組織TNFα、scf、c-kit蛋白表達(dá)變化 將豚鼠膽囊平滑肌組織固定在4%聚甲醛溶液中，并包埋在石蠟中，制成4 μm厚的切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶及加熱抗原修復(fù)后，用正常兔血清在室溫下封閉30 min，加入一抗，置于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜；PBS漂洗后加入二抗，室溫下孵育50 min；PBS漂洗后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。采用Image Pro Plus測(cè)量出每張圖片的累積光密度值(integrated option density，IOD)以及區(qū)域面積 area值，再計(jì)算出平均光密度值(mean density)=IOD/area，最后取每個(gè)樣本的5個(gè)隨機(jī)區(qū)域的平均光密度值作為該樣本目的蛋白的值。

2.3.3 Western blot檢測(cè)膽囊組織TNFα表達(dá) 取液氮凍存的豚鼠膽囊組織，經(jīng)粉碎、裂解、離心后提取蛋白上清液，將提取的蛋白與5×蛋白上樣緩沖液混合均勻后煮沸10 min使蛋白變性，檢測(cè)蛋白濃度，計(jì)算上樣體積；經(jīng)梯度電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上；5%脫脂乳室溫下封閉1 h；4 ℃過夜孵育一抗，常溫孵育二抗1 h，TBST緩沖液洗滌3次后，采用ECL進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，于凝膠成像儀下拍照，獲取圖片。

3 結(jié)果

3.1 各組豚鼠體質(zhì)量的變化情況 經(jīng)過8周喂養(yǎng)，正常組豚鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)最低，中藥組次之，模型組最高(圖1)。

圖1 豚鼠體質(zhì)量的變化情況

3.2 各組豚鼠膽囊組織的病理HE染色情況 正常組豚鼠膽囊組織結(jié)構(gòu)完整，膽囊黏膜表面的單層柱狀上皮細(xì)胞排列整齊、緊密，無異常增生，無明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組豚鼠膽囊組織黏膜水腫、增厚，單層柱狀上皮細(xì)胞排列紊亂，黏膜層和肌層中大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以中性粒細(xì)胞為主；中藥組豚鼠膽囊黏膜表面的單層柱狀上皮細(xì)胞排列整齊，黏膜未見明顯增厚，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組減輕(圖2)。

注：a，正常組；b，模型組；c，中藥組。

3.3 各組豚鼠膽囊組織中TNFα的表達(dá)情況 Western blot實(shí)驗(yàn)、免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，在豚鼠膽囊組織中，與正常組相比，模型組TNFα的表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，中藥組TNFα的表達(dá)水平呈降低趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3～5，表1)。

圖3 大黃靈仙方干預(yù)下TNFα的表達(dá)情況

圖4 大黃靈仙方對(duì)TNFα表達(dá)水平的影響

3.4 各組豚鼠膽囊平滑肌組織中scf、c-kit的表達(dá)情況 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組、中藥組豚鼠膽囊平滑肌組織中scf、c-kit的表達(dá)水平均下降(P值均<0.05)；與模型組相比，中藥組豚鼠膽囊平滑肌組織中scf、c-kit的表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(圖5，表1)。

圖5 大黃靈仙方干預(yù)下TNF、scf、c-kit的表達(dá)情況(免疫組化，×100)

表1 大黃靈仙方對(duì)TNFα、scf、c-kit表達(dá)水平的影響

4 討論

膽囊收縮功能下降是膽囊結(jié)石形成的重要原因，膽囊ICC減少對(duì)膽囊收縮功能的影響也起到了至關(guān)重要的作用。ICC是1893年西班牙神經(jīng)解剖學(xué)家圣地亞哥·拉蒙·卡哈爾發(fā)現(xiàn)的分布在消化道自主神經(jīng)末梢和平滑肌細(xì)胞之間的一類特殊細(xì)胞，特異性表達(dá)3型酪氨酸激酶生長(zhǎng)因子受體c-kit，主要參與消化道基本電節(jié)律的產(chǎn)生和調(diào)控，對(duì)維持消化道正常運(yùn)動(dòng)功能起決定性作用[11]。2000年，Ortiz-Hidalgo等[12]發(fā)現(xiàn)膽囊間質(zhì)瘤細(xì)胞的表型與ICC相似；2007年，Lavoie等[13]在豚鼠膽囊中發(fā)現(xiàn)了ICC；2012年，Pasternak等[14]在人體膽囊組織中發(fā)現(xiàn)了ICC，并認(rèn)為其與膽囊產(chǎn)生和傳播自發(fā)性節(jié)律有關(guān)。

在膽囊中，ICC存在于固有肌層和上皮下結(jié)締組織層，通過縫隙連接和c-kit與膽囊平滑肌細(xì)胞形成電耦合，并參與膽囊固有肌層自發(fā)節(jié)律性電活動(dòng)的產(chǎn)生和起搏[13]。其產(chǎn)生機(jī)制為：膽囊ICC通過自發(fā)的細(xì)胞內(nèi)鈣振蕩產(chǎn)生慢波(slow wave，SW)電位，SW電位通過上述ICC網(wǎng)絡(luò)傳播至與之相連的平滑肌細(xì)胞，刺激并調(diào)節(jié)平滑肌活動(dòng)[15]。研究表明，ICC具有高度的可塑性[16-18]和再生能力[19]。其特異性標(biāo)志物為c-kit，表達(dá)于ICC的質(zhì)膜上[20]，可以編碼kit。scf是c-kit受體的天然配體，c-kit及scf組成的scf/c-kit信號(hào)通路在ICC的發(fā)育、分化及表型維持中起重要作用[21]，當(dāng)c-kit受體被scf激活后，兩分子c-kit與兩分子scf在胞外結(jié)構(gòu)域1～3區(qū)分別進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)而引起c-kit的二聚化，激活細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶，導(dǎo)致酪氨酸自動(dòng)磷酸化，啟動(dòng)MAP激酶和JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑導(dǎo)致細(xì)胞分化和增殖[22]。而當(dāng)scf/c-kit信號(hào)通路受損時(shí)，c-kit及其mRNA表達(dá)下降，可引起ICC數(shù)量、形態(tài)及功能異常。

研究[23-24]表明，當(dāng)膽囊內(nèi)膽固醇濃度增高時(shí)，氧自由基系統(tǒng)被激活，釋放大量活性氧，引起膽囊組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，使ICC發(fā)生凋亡，導(dǎo)致其數(shù)量減少，膽囊收縮功能下降，膽汁不能及時(shí)排出，膽汁過飽和而致膽固醇結(jié)晶析出，形成膽囊結(jié)石；除此之外，膽囊壁的長(zhǎng)期慢性炎癥浸潤(rùn)可引起TNFα的釋放，而TNFα的釋放可激發(fā)TNFα/胱天蛋白酶8/胱天蛋白酶3的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)ICC凋亡[25]。

中醫(yī)藥對(duì)膽石癥的治療由來已久，許多臨床實(shí)踐及實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了其在緩解患者臨床癥狀、溶石排石及改善血清學(xué)指標(biāo)等方面具有確切的療效。大黃靈仙方是唐乾利老師總結(jié)十多年臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)制的目前仍在應(yīng)用的有效中藥復(fù)方，該方以疏肝利膽、攻下排石為立方原則，全方由生大黃、威靈仙、芒硝、金錢草、枳殼、雞內(nèi)金、澤蘭、柴胡、郁金、磁石、黃芪、炙甘草等藥物組成，臨床上常用于膽石癥的治療。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)該方中的威靈仙、金錢草、郁金等中藥具有促進(jìn)膽囊收縮的作用，結(jié)合膽囊動(dòng)力功能障礙是導(dǎo)致膽固醇結(jié)石形成的關(guān)鍵因素的論點(diǎn)，為探索其發(fā)揮作用的機(jī)制，筆者通過閱讀大量文獻(xiàn)后猜測(cè)其可能與膽囊ICC及其內(nèi)部的scf/c-kit信號(hào)通路有關(guān)，為了進(jìn)一步驗(yàn)證，課題組通過觀察各組豚鼠膽囊病理情況并且應(yīng)用Western blot及免疫組化檢測(cè)二者之間的關(guān)系。病理結(jié)果顯示，正常組豚鼠膽囊組織結(jié)構(gòu)完整，無明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組膽囊組織可見水腫、增厚、細(xì)胞排列紊亂及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；中藥組膽囊組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度較模型組明顯減輕，表明大黃靈仙方有助減輕膽囊組織病理損傷。Western blot結(jié)果顯示，在豚鼠膽囊組織中，相較于模型組，中藥組TNFα的表達(dá)量呈降低趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明大黃靈仙方能減輕膽囊組織炎癥反應(yīng)。免疫組化結(jié)果顯示，與模型組相比，中藥組豚鼠膽囊平滑肌組織中scf、c-kit的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，表明大黃靈仙方可以促進(jìn)scf、c-kit蛋白的活化從而增強(qiáng)膽囊收縮功能。

綜上所述，大黃靈仙方可以通過下調(diào)TNFα的表達(dá)水平，減輕炎癥反應(yīng)，從而減輕ICC的凋亡；可以通過上調(diào)scf、c-kit的表達(dá)水平誘導(dǎo)ICC分化和增殖，增加ICC的數(shù)量，進(jìn)而增強(qiáng)膽囊動(dòng)力功能，最終達(dá)到減少膽囊膽固醇結(jié)石發(fā)生及術(shù)后復(fù)發(fā)的目的。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2021年5月25日經(jīng)由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：DW20191017-023，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：肖麗君負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，擬定寫作思路，撰寫論文；甘苡榕參與資料分析，修改論文；劉春麗、李承積、楊文、龐澆安、滕金豪負(fù)責(zé)文獻(xiàn)檢索，收集數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；俞淵負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。