α7nAChR激動劑經內質網應激調控NLRP3炎癥小體改善缺氧缺血性腦損傷的分子機制研究*

蔡群，張曉群，張志軍，沈麗媛

（1.南通大學附屬醫(yī)院 兒科，江蘇 南通 226001； 2.南通大學醫(yī)學院 解剖教研室，江蘇 南通 226001）

缺氧缺血性腦損傷（hypoxic ischemic brain damage, HIBD）作為臨床常見的新生兒神經疾病之一，若干預不及時可導致智力發(fā)育不足、癲癇等后遺癥，給家庭和社會帶來較大的影響[1]。α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7nAChR）主要表達在巨噬細胞表面，經其配體激活后參與膽堿能抗炎通路，可降低機體炎癥水平。有研究[2]發(fā)現，α7nAChR激動劑能減輕HIBD大鼠的神經系統(tǒng)損傷，可能與其抑制炎癥作用有關。NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）是一種能被多種外源物質及自身危險信號激活的炎癥小體，目前已經發(fā)現其參與了多種神經系統(tǒng)炎癥相關疾病[3]。此外，內質網應激（endoplasmic reticulum stress, ERS）參與激活NLRP3，但在不同類型細胞中的具體調控機制不同[4]。本研究擬探討α7nAChR激動劑通過介導ERS調控NLRP3炎癥小體表達對HIBD的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器

實驗動物：選擇出生7 d左右的SPF級SD雄性大鼠48只，體重11～14 g，每12 h晝夜燈光輪流照射，環(huán)境溫度22～24 ℃，自由取食和飲水。所有大鼠均由北京維通利華動物技術有限公司提供[動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0008；動物使用許可證號：SYXK（京）2020-0024]。本研究嚴格遵守3R原則并經醫(yī)院動物委員會批準。試劑：α7nAChR激動劑PNU282987（上海碧云天生物技術有限公司），白細胞介素-18（IL-18）、白細胞介素-1β（IL-1β）ELISA試劑盒（合肥萊爾生物科技有限公司），TTC染色試劑盒（上海聯(lián)邁生物工程有限公司），蘇木精-伊紅染液（上海信帆生物科技有限公司），TUNEL檢測試劑盒（美國Roche公司），BCA蛋白定量試劑盒（合肥萊爾生物科技有限公司）。儀器：小動物行為分析系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司XR-Xmaze型），酶標儀（型號：ST-MB96A，山東三體儀器有限公司），倒置顯微鏡（型號：CKX53，日本奧林巴斯株式會社），電泳儀（型號：16-8033，美國伯樂公司）。

1.2 實驗動物分組、模型復制及給藥

48只大鼠隨機分為假手術組（S組）、模型組（HIBD組）、HIBD +α7nAChR激動劑PNU282987組（HP組），每組16只。HIBD組和HP組大鼠均進行HIBD模型復制；S組進行假手術，不做結扎和缺氧處理。HIBD組和HP組均采用改良Rice法復制HIBD模型：腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定在實驗臺上，碘伏消毒頸部，頸部正中偏左縱行5 mm切開皮膚，鈍性分離皮下組織和肌肉，暴露頸動脈三角區(qū)，剝離出迷走神經，采用5-0絲線結扎頸總動脈近心端和遠心端，縫合消毒。術后將幼鼠放回母鼠旁休息1 h后放置在缺氧箱（92% N2+ 8% O2）中缺氧處理2.5 h，缺氧過程大鼠出現晃頭、抽搐，缺氧處理結束后出現肢體癱瘓、站立不穩(wěn)、四肢抖動、夾尾、無法自主行走等癥狀視為模型復制成功。HP組模型復制成功后1 h腹腔注射0.8 mg/kg PNU282987，HIBD組和S組同時間腹腔注射0.02 mL/g生理鹽水。

1.3 水迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力

術后48 h每組大鼠均開展水迷宮實驗，將一個圓形水池（直徑= 180 cm，高= 50 cm）等分為4個象限，中央原點放置一個低于水面1 cm的圓形平臺（直徑= 9 cm），水中加入染料隱蔽圓臺，水溫保持在22～25 ℃，采用小動物行為分析系統(tǒng)測定大鼠逃避潛伏期和2 min內穿越圓臺的次數。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測IL-18、IL-1β水平

水迷宮實驗結束后2 h，給予大鼠注射戊巴比妥鈉麻醉，抽取其外周靜脈血，離心取上清液，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，將標準品和稀釋樣品分別加入到時孔板，并設置空白組和空白凋零組作為對照，在孔板上粘上覆膜，室溫孵育2 h后移去酶標板液體并洗滌，隨后加入生物素化抗體、Streptavidin-HRP各100 μL，室溫孵育后洗滌，隨后顯色，在450 nm波長處測定OD值，并根據標準曲線讀出樣本濃度，再乘以稀釋倍數，計算出IL-18、IL-1β實際濃度。

1.5 HE染色觀察腦組織病理改變

取大腦組織并在4% 甲醛中固定過夜，石蠟包埋、切片，經二甲苯和酒精脫蠟置水后進行HE染色，光學顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)變化。

1.6 TTC染色法檢測腦梗死面積

將各實驗組大鼠斷頭法處死，取出完整大腦置于-20 ℃冰箱冷凍20 min后取出，快速自前腦額極平行切成厚度約2 mm的冠狀切片，將其放入TTC染液中避光孵育20 min，每隔5 min將切片翻轉1次，染色結束后取出，用PBS沖洗干凈，相機拍照。腦梗死面積百分比（%）=梗死面積/橫切片總面積×100%。

1.7 TUNEL法檢測大腦皮質、海馬CA1區(qū)神經細胞凋亡情況

按照1.6中方法獲取各組大鼠腦組織及左側海馬體石蠟切片，采用TUNEL染色試劑盒檢測神經細胞凋亡，找到每張切片上大腦皮質、海馬CA1區(qū)域，光學顯微鏡下觀察，棕黃、棕褐色細胞為凋亡細胞，藍色為正常細胞。隨機選擇5個高倍鏡視野，計算細胞凋亡，細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數/視野總細胞數×100%。

1.8 Western blotting檢測腦組織中NLRP3、GRP78、CHOP蛋白表達

取各組大鼠左側海馬組織在冰上研磨并加入細胞裂解液，取上清液采用BCA標準蛋白定量化測定蛋白濃度，合格后取50 μL樣品進行SDSPAGE電泳，轉膜、封閉，分別加入NLRP3、葡萄糖調節(jié)蛋白78（glucose regulated protein78, GRP78）、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein, CHOP）一抗（稀釋濃度均為1∶1 000）孵育過夜、加二抗室溫孵育2 h，加入ECL顯色液在暗室下曝光顯影，以β-actin為內參，計算NLRP3、GRP78、CHOP蛋白相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組的比較用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠水迷宮實驗逃避潛伏期和穿越圓臺次數的比較

水迷宮實驗結果顯示，S組、HIBD組及HP組逃避潛伏期、穿越圓臺次數比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），HIBD組和HP組逃避潛伏期較S組延長（P＜0.05），穿越圓臺次數較S組減少（P＜0.05）；HP組逃避潛伏期較HIBD組縮短（P＜0.05），穿越圓臺次數較HIBD組增加（P＜0.05）。見表1。

表1 3組大鼠水迷宮實驗逃避潛伏期和穿越圓臺次數的比較 （n =16，±s）

表1 3組大鼠水迷宮實驗逃避潛伏期和穿越圓臺次數的比較 （n =16，±s）

注 ： ①與S組比較，P ＜0.05； ②與HIBD組比較，P ＜0.05。

組別S組HIBD組HP組F 值P 值逃避潛伏期/s 6.82±1.84 26.04±5.72①16.08±4.13①②26.024 0.000穿越圓臺次數10.63±2.42 2.23±0.54①6.53±1.58①②15.054 0.000

2.2 3組大鼠血清IL-18、IL-1β水平比較

ELISA檢測結果顯示，S組、HIBD組和HP組IL-18、IL-1β水平比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），HIBD組和HP組IL-18、IL-1β水平較S組升高（P＜0.05），HP組IL-18、IL-1β水平較HIBD組降低（P＜0.05）。見表2。

表2 3組大鼠血清IL-18、IL-1β水平的比較（n =16，pg/mL，±s）

表2 3組大鼠血清IL-18、IL-1β水平的比較（n =16，pg/mL，±s）

注 ： ①與S組比較，P ＜0.05； ②與HIBD組比較，P ＜0.05。

組別S組HIBD組HP組F 值P 值IL-18 47.23±8.24 155.36±14.38①109.26±11.37①②125.084 0.000 IL-1β 28.15±4.02 92.34±10.26①58.6±7.25①②26.258 0.000

2.3 3組大鼠腦組織病理改變

HE染色結果顯示，S組腦皮層完整，細胞排列正常，無明顯神經元損傷；HIBD組可見腦皮層神經元排列較為紊亂，細胞間隙變寬，細胞膜破裂；HP組神經元排列紊亂，水腫程度、壞死程度較HIBD組輕。見圖1。

圖1 3組大鼠腦組織病理改變 （HE染色×400）

2.4 3組大鼠腦梗死面積比較

TTC染色結果顯示，S組、HIBD組和HP組腦梗死面積的占比分別為（0.02±0.01）%、（27.16±4.38）%、（18.29±3.96）%，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=256.158，P=0.000）。其中S組無明顯梗死灶，HIBD組和HP組均可見白色梗死灶，HP組梗死面積占比明顯低于HIBD組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 大鼠腦梗死面積 （TTC染色）

2.5 3組大鼠腦皮層、海馬CA1區(qū)神經細胞凋亡率比較

TUNEL法檢測結果顯示，S組、HIBD組和HP組腦皮層和海馬CA1區(qū)神經細胞凋亡率比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），HIBD組和HP組腦皮層和海馬CA1區(qū)神經細胞凋亡率較S組升高（P＜0.05），HP組腦皮層和海馬CA1區(qū)神經細胞凋亡率較HIBD組降低（P＜0.05）。見表3。

表3 3組大鼠腦皮層、海馬CA1區(qū)神經細胞凋亡率比較 （n =16，%，±s）

表3 3組大鼠腦皮層、海馬CA1區(qū)神經細胞凋亡率比較 （n =16，%，±s）

注 ： ①與S組比較，P ＜0.05； ②與HIBD組比較，P ＜0.05。

組別S組HIBD組HP組F 值P 值腦皮層0.97±0.43 43.24±6.83①23.86±5.22①②92.056 0.000海馬CA1區(qū)1.03±0.54 43.72±6.05①17.83±4.26①②124.056 0.000

2.6 3組大鼠腦組織中NLRP3、GRP78、CHOP蛋白表達比較

Western blotting檢測結果顯示，S組、HIBD組和HP組NLRP3、GRP78、CHOP蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），HIBD組、HP組NLRP3、GRP78、CHOP蛋白相對表達量較S組升高（P＜0.05），HP組NLRP3、GRP78、CHOP蛋白相對表達量較HIBD組降低（P＜0.05）。見 表4和圖3。

圖3 3組大鼠腦組織中NLRP3、GRP78、CHOP蛋白表達

表4 3組大鼠腦組織中NLRP3、GRP78、CHOP蛋白相對表達量比較 （n =16，±s）

表4 3組大鼠腦組織中NLRP3、GRP78、CHOP蛋白相對表達量比較 （n =16，±s）

注 ： ①與S組比較，P ＜0.05； ②與HIBD組比較，P ＜0.05。

組別S組HIBD組HP組F 值P 值CHOP蛋白1.11±0.22 2.05±0.51①1.53±0.42①②3.264 0.018 GRP78蛋白0.97±0.18 6.16±0.54①2.38±0.32①②7.264 0.000 NLRP3蛋白1.04±0.28 7.75±1.32①5.36±0.87①②26.251 0.000

3 討論

HIBD多由圍生期窒息所引發(fā)的新生兒腦損傷疾病，其病理機制與炎癥所引發(fā)的神經元炎癥因子浸潤和神經細胞凋亡密切相關[5]。目前HIBD尚無確切有效的治療方法，臨床常采用的亞低溫治療，預后并不十分理想[6]，而深入了解HIBD發(fā)病機制對尋找更有效的治療方法具有重要意義。

α7nAChR是一種表達在神經細胞、免疫細胞等多種細胞表面的配體依賴性離子通道受體，主要有抗炎作用[7-8]。相關研究[9]顯示，α7nAChR激動劑能通過抑制炎癥因子表達改善體循環(huán)引發(fā)的大鼠腦損傷，但在HIBD中的作用尚不明確。本研究結果顯示，HIBD模型復制成功后，HIBD組大鼠逃避潛伏期延長，穿越圓臺次數減少，表現為大腦神經功能異常，而在注射α7nAChR激動劑后HP組大鼠逃避潛伏期縮短，穿越圓臺次數增加，提示α7nAChR激動劑可改善大鼠大腦神經功能。HE染色結果也證實了這一點。此外，HIBD組、HP組腦梗死面積占比、腦皮層和海馬CA1區(qū)神經細胞凋亡比例較S組升高，HP組腦梗死面積占比、腦皮層和海馬CA1區(qū)神經細胞凋亡率較HIBD組降低，表明α7nAChR激動劑可能通過減少神經細胞凋亡來改善神經功能，而炎癥因子的大量表達可能參與了此過程[10]。

NLRP3是NLR家族研究最多的炎癥小體，目前已經發(fā)現其參與了HIBD的發(fā)生、發(fā)展過程[11]。相關研究[12-14]顯示，巨噬細胞、膠質細胞等免疫細胞可在多種炎癥因子的刺激下激活細胞質中NLRP3炎癥小體，如外界炎癥信號誘導的ERS可通過K+外流、溶酶體損傷模型和活性氧（ROS）途徑激活NLRP3。本次研究發(fā)現，HIBD組、HP組NLRP3、GRP78、CHOP蛋白相對表達量較S組升高，HP組NLRP3、GRP78、CHOP蛋白相對表達量較HIBD組降低，提示α7nAChR激動劑可能通過抑制ERS途徑相關GRP78/CHOP通路蛋白表達來降低腦組織中NLRP3炎癥小體的表達。馬度芳等[15]發(fā)現，α7nAChR激動劑能抑制ERS途徑和穩(wěn)定線粒體功能，減少ROS釋放；而ROS大量釋放可刺激NLRP3炎癥小體激活[16]，這可能是α7nAChR激動劑能降低NLRP3表達的原因之一。而NLRP3炎癥小體激活后可通過相關信號促進IL-18、IL-1β等炎癥因子的成熟和大量表達，釋放的IL-18、IL-1β可募集更多其他的炎癥因子和細胞，導致腦組織炎癥損傷[17-18]。本研究結果顯示，HIBD組、HP組血清IL-18、IL-1β水平較S組升高，HP組血清IL-18、IL-1β水平較HIBD組降低，提示α7nAChR激動劑能降低HIBD大鼠體內的炎癥水平。LEAVY等[19]認為，腦組織受損及神經細胞能量代謝紊亂能誘導機體發(fā)生ERS，出現錯誤折疊和未折疊的蛋白聚集，激活NLRP3和相關炎癥因子的表達，導致大鼠發(fā)生腦梗死和神經功能障礙。BECKMANN等[20]研究發(fā)現，新生大鼠與成年大鼠在HIBD實驗中NLRP3表達出現峰值時間存在差異，可能與HIBD的不同發(fā)展階段有關，具體情況有待進一步研究論證。

綜上所述，α7nAChR激動劑可改善大鼠HIBD腦損傷，其機制可能與抑制ESR途徑、降低NLRP3炎癥小體表達有關，NLRP3及相關炎癥因子的表達在大鼠神經元損傷及神經細胞凋亡中發(fā)揮了保護作用，這可能為HIBD治療藥物研究提供新的思路和方向。