R-spondins與乳腺癌的相關性研究進展*

蔣樹云，馬德壽，馬志軍

（1.青海大學研究生院，青海 西寧 810016； 2.青海大學附屬醫院 腫瘤外科，青海 西寧 810001）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發病率位居我國女性惡性腫瘤首位[1]。探究乳腺癌發病的分子機制，尋找有效的治療靶點和預后標志物一直是該領域的研究熱點。R-spondins也稱為特異性頂部盤狀底板反應蛋白（RSPO），是近期發現的一種分泌蛋白質家族，存在于所有脊椎動物中，在機體的發育、血管形成等方面扮演重要角色[2]，近期研究表明，該蛋白家族在包括乳腺癌等多種惡性腫瘤的發生發展中發揮重要作用[3-5]。因此，本文深入研究RSPO在乳腺癌中發揮的功能及相關發病機制，為乳腺癌的精準治療、預后評估等提供新的方向。

1 RSPO的結構和功能

RSPO是由凝血酶刺激的血小板中分離出的一種新型分泌蛋白質家族，由4種蛋白成員（RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4）組成，相互之間有40%～60%的氨基酸相似性，共有4個主要的功能區：N端為一段富含疏水氨基酸的分泌信號肽，其次為兩段富含半胱氨酸的Furin樣蛋白質結構域，緊跟一段血栓反應蛋白1型重復結構域（thrombo spondin1 repeats, TSR1），C端為一段可變長度的富含堿性氨基酸的結構域（basic amino acidrich, BR）。其中Furin樣1結構域和Furin樣2結構域分別與鋅環指蛋白3/E3泛素連接酶-環指蛋白43（zinc and ring finger 3/ring finger protein 43, ZNRF3/RNF43）和富含亮氨酸的G蛋白偶聯受體（leucine-rich repeat G protein-coupled receptors4-6,LGR4-6）相結合，RSPO-LGR（LGR4-6）構成了一個配體-受體系統，與ZNRF3/RNF43結合形成穩定三元復合物進入到細胞內，避免卷曲跨膜受體（Frizzled, FZD）的降解從而激活Wnt通路[6-8]。Furin樣結構域是RSPO激活Wnt/β-catenin信號通路充分且必要的條件，并決定著RSPO的活性強度[8-9]。

前期研究[10]表明，激素受體陽性的乳腺管腔細胞分泌的RSPO1在核因子κB受體協同作用下，通過活化Wnt通路而促進小鼠乳腺的發育；而在雌激素受體陰性的管腔細胞分泌的雙調蛋白可通過誘導RSPO1的表達，形成雌激素-雙調蛋白-RSPO1的調節軸，為乳腺的發育提供了特殊的調控模式[11]。此外，卵巢激素可通過調節RSPO1和Wnt4的協同作用促進乳腺上皮干細胞（mammary stem cell, MaSC）的自我更新和再生能力，這為體外培養擴增MaSC并保持其特性提供了一種可能[12]。在性腺分化階段，RSPO1的缺失會導致部分性反轉表型從而出現性反轉現象，因此RSPO1的存在對調控性別差異是十分必要的[7]。而RSPO3通過調控Wnt通路、促進血管母細胞的分化等途徑調節造血細胞與血管內皮細胞分化之間的平衡，在血管生成和胚胎發育方面發揮重要功能[7，13]。此外，正常乳腺間質和小鼠乳腺的基底干細胞富集區均發現了RSPO3的表達，提示其可能參與正常乳腺的發育，抑制乳腺腔室的分化[14]。RSPO2和RSPO4在正常乳腺中的研究尚未見報道，有報道[7]稱RSPO2可通過Wnt通路促進胚胎肌肉、呼吸道及毛囊的發育，而RSPO4被認為在指甲形態的發育中扮演重要角色。

2 RSPO受體LGR4-6的結構及功能

作為RSPO高親和力的細胞膜受體，LGR4-6屬于LGR家族中的B型受體，由長達17個富含亮氨酸基序列的結構域，以及氮端的富含亮氨酸基序列和碳端的富含亮氨酸基序列構成[15]。LGR4-6因在促進胚胎發育、維持成人組織穩態中發揮重要功能而受到關注[16]。近期研究[17]表明，LGR4-6也參與乳腺的生長發育，LGR4缺失的小鼠表現為乳腺發育遲緩、乳腺導管分支減少及MaSC增殖能力降低的特點。利用3D成像等技術觀察到LGR5在管腔細胞和基底細胞中可促進乳腺腺泡的形成，其在乳腺移植后的機體內能有效地重建乳房[18-19]。而在妊娠狀態下，LGR6與其配體結合后通過增強腺泡細胞的增殖能力從而促進乳腺腺泡發育[20]。總之，上述研究表明，LGR4-6通過與其配體RSPO結合后在乳腺發育的不同階段發揮特殊的動態調控功能。

3 RSPO在乳腺癌中的表達

目前研究提示，RSPO在乳腺癌組織中的表達特征不盡一致。有研究[21]結果表明，RSPO1在孕激素受體陽性的乳腺癌組織中表達顯著升高，進一步分析提示其水平與患者無病生存期顯著相關，可作為浸潤性導管癌獨立的預后因子。COUSSY等[4]在446例乳腺癌包括三陰性乳腺癌（triplenegative breast cancer, TNBC）和化生性乳腺癌（metaplastic breast cancer, MBC）中檢測RSPO的結果表明，與癌周組織比較，RSPO2和RSPO4在癌組織中的表達明顯升高，尤其在TNBC和MBC中表達更加顯著，而RSPO1和RSPO3的表達卻無明顯差別；此外，其相關受體LGR4-6也呈高表達狀態，且主要以LGR4為主；CONBOY等[22]研究也提示，RSPO2在乳腺癌中呈高表達，進一步分析表明，其在基底細胞樣型和HER-2過表達型中表達更為顯著；而TOCCI等[14]研究結果卻表明，RSPO3及其相關受體LGR4-6、Runt相關轉錄因子在基底細胞樣亞型的乳腺癌中呈顯著高表達，且3者的水平呈明顯的正相關；此外，筆者也運用癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas, TCGA）數據庫檢索了RSPO在乳腺癌組織中的表達特征，與癌旁組織相比，RSPO2和RSPO4在乳腺癌中呈高表達，而RSPO1和RSPO3卻呈低表達（見圖1）。進一步分析RSPO在乳腺癌各分子亞型中的表達特征顯示：RSPO2和RSPO4在基底細胞樣型中的表達顯著升高，而RSPO1和RSPO3在各分子亞型中的水平較癌旁組織明顯降低，尤其在基底細胞樣型中更為顯著，推測其在乳腺癌中可能作為一種潛在的抑癌基因（見圖2）。然而該數據庫部分結果與上述研究結果不盡一致，如RSPO1雖在孕激素受體陽性的乳腺癌中升高，但TCGA數據庫卻顯示其在乳腺癌中呈低表達，分析其原因可能與以下幾點相關：①鑒于腫瘤的時間、空間異質性，使所取組織可能由于分子水平層面的不同，導致檢測結果的差異性；②RSPO與相關受體結合后的檢測不能反映其真實的表達水平[23]；③研究中使用的檢測方法、儀器設備、試劑等差異也可能導致RSPO檢測結果不一致。

圖1 TCGA數據庫中RSPO在乳腺癌中的表達特征 （±s）

圖2 TCGA數據庫中RSPO在各乳腺癌分子亞型中的表達 （±s）

4 RSPO在乳腺癌中的功能

RSPO作為一種新型分泌蛋白質家族，其成員不僅在維持乳腺的生長發育中發揮重要的生理功能，而且其表達失調時還與乳腺癌的發展演進相關。KLAUZINSKA等[24]在小鼠乳腺腫瘤病毒（mouse mammary tumor virus, MMTV）誘導的小鼠乳腺腫瘤中發現RSPO2可作為一個MMTV新的共同整合位點，在HC11細胞中RSPO2過表達或與Wnt1共表達都會產生紡錘形的惡性細胞漩渦繼而在小鼠體內形成腫瘤，當RSPO2和Wnt1共表達時則顯著增強細胞的侵襲能力，并表現出強烈的上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）樣特征并易轉移到肺和脾臟。此外，在乳腺癌細胞中RSPO2-LGR4通過調控Dickkopf-1相關蛋白的分泌而建立乳腺癌骨轉移前的微環境，繼而促進乳腺癌骨轉移的進程[25]；而COUSSY等[4]報道進一步表明，RSPO2的表達量與乳腺癌患者的無轉移生存期呈負相關，提示其也許可作為一種潛在的預后指標；THEODOROU等[26]研究顯示，RSPO3在P53缺失的乳腺上皮細胞中表達升高且有明顯的致癌作用；TOCCI等[14]在小鼠模型中發現RSPO3可誘導腫瘤干細胞（cancer stem cell, CSC）和EMT相關基因如波形蛋白和纖維鏈接蛋白的表達，并促進乳腺癌細胞的侵襲和遷移；TER等[27]研究也表明，高表達RSPO3的乳腺癌組織分化程度更低、侵襲能力更強。上述部分研究提示RSPO3在乳腺癌組織中呈高表達并發揮促癌作用，這與上述生物信息學提示的其可能作為潛在抑癌基因的結論相反，因此推測RSPO在腫瘤中發揮的功能可能具有組織和細胞特異性，如miR-155在肺癌中被認為是促癌基因[28]，而在胃癌中卻發揮抑癌功能[29]；COUSSY等[4]研究進一步表明，RSPO4與乳腺癌的病理組織分級、雌激素受體狀態和TNBC亞型密切相關，過表達RSPO4可通過增強乳腺癌細胞中β-catenin、軸抑制蛋白2的表達而激活Wnt通路，繼而促進腫瘤的發展演進。針對上述具有促癌特征的RSPO，通過研發相應的靶向藥物抑制其表達，可為乳腺癌的精準治療提供參考。

5 RSPO在乳腺癌中的調控機制

5.1 RSPO與Wnt通路

Wnt/β-catenin通路的過度活化是腫瘤發生發展的經典機制之一，Wnt配體通過結合FZD和低密度脂蛋白相關蛋白5或6（lipoprotein-related protein5/6, LRP5/6）而誘導胞質、多蛋白破壞復合物釋放出β-catenin蛋白來激活Wnt通路[30]。前期研究表明，β-catenin蛋白在乳腺癌細胞中的累積導致Wnt信號頻繁被激活可能是乳腺癌發生的機制之一[31]。但最近的研究結果卻表明乳腺癌中Wnt通路的異常激活不一定依賴β-catenin蛋白的累積[30]，分析可能存在激活Wnt通路的其他途徑。

TOCCI等[30]研究表明，RSPO結合受體LGR4-6并誘導結合ZNRF3/RNF43的自泛素化和膜清除，促使細胞膜表面的FZD累積，繼而激活經典的Wnt信號通路（圖3-①），而在一些LGR（LGR4-6）低表達或不表達的細胞中，RSPO可通過TSR結構域或BR結構域與細胞膜外的硫酸肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans, HSPG）的相互作用（圖3-②），為ZNRF3/RNF43提供一條不依賴于LGR的通路，分析HSPG很可能是RSPO的共受體，在促進LGR低表達或不表達的乳腺癌進展中發揮重要功能[6，32]。其次，在清除了ZNRF3/RNF43的情況下，RSPO-LGR復合體還可通過招募GTP酶激活蛋白1（IQGAP1）（圖3-③），在清除了ZNRF3/RNF43的機制中增強Wnt通路活性[30，32]，從而使RSPO激活Wnt通路的作用形式更加豐富。綜上，在不依賴β-catenin蛋白累積的情況下，RSPO通過結合不同的受體或受體組合激活Wnt通路，繼而發揮促癌功能。然而RSPO在特定的環境下是如何選擇不同受體或受體組合激活Wnt通路的具體機制目前尚不明確，有必要開展進一步的研究。

圖3 RSPO激活Wnt通路的新途徑 （圖片由Medpeer網站繪制）

5.2 RSPO受體LGR與乳腺癌

如前所述，LGR4-6參與調控不同階段乳腺的生長發育。而在乳腺癌中，YUE等[33]發現LGR4在癌組織中表達上調，其通過調節性別決定基因相關轉錄因子的表達維持乳腺癌CSC的功能，從而促進癌細胞的增殖和更新；而在細胞的侵襲和轉移機制中，局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）與腫瘤細胞的黏附、擴散密切相關，LGR4則通過FAK-類固醇受體輔助活化因子途徑協調肌動蛋白動力學調控機制從而促進癌細胞的侵襲、遷移；乳腺癌中高表達的LGR5主要通過蛋白激酶A激活β-catenin的活性，繼而促進腫瘤細胞的增殖、遷移并增加順鉑的耐藥性[34]。上述研究表明在乳腺癌組織中，異常表達的LGR可通過RSPO-LGR系統發揮促癌功能，還可通過單獨調控下游相關基因的表達參與腫瘤的進展。如靶向抑制LGR的水平，也許在臨床上可發揮雙重抑制腫瘤的效果。

5.3 RSPO及其受體LGR介導EMT特征

EMT是上皮來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的關鍵步驟。有研究報道在高表達RSPO2的乳腺癌組織中檢測到間充質蛋白標志物，如波形蛋白、纖維連接蛋白、N-鈣黏蛋白等，而未發現上皮標志物E-鈣黏蛋白、細胞骨架角蛋白的表達，表現出與EMT一致的基因表達譜，使得腫瘤更易向周圍組織侵襲轉移[24]。體外實驗也表明，與rRSPO3共培養的乳腺細胞中，間充質標志物纖維連接蛋白和波形蛋白的表達顯著增加，而E-鈣黏蛋白減少，提示其可能通過誘導細胞發生EMT而發揮促癌作用[14]。此外，在MDA-MB-231細胞中，抑制LGR4的表達后EMT間充質蛋白標志物水平明顯減少，進一步分析表明其通過誘導Wnt/β-catenin通路介導EMT發生[34]。鑒于EMT被認為是導致腫瘤轉移的關鍵病理過程，因此積極探索靶向調控誘導EMT發生的關鍵分子對乳腺癌的治療具有重大的意義。

6 結語與展望

乳腺癌的放化療由于嚴重的毒副反應在臨床實踐中存在諸多限制。目前，個體化的精準靶向治療已成為新型的腫瘤治療模式。作為一種新型的分泌蛋白質家族，在生理狀態下RSPO不僅參與血管形成、促進胚胎、乳腺等器官的發育；而在乳腺癌組織中，其表達出現顯著的失調，異常表達的RSPO與乳腺癌的分子亞型、預后等顯著相關；RSPO還與其受體LGR4-6在促進乳腺癌細胞生長、轉移、EMT發生、誘導CSCs的活性方面發揮重要的功能；此外，作為一種新型的Wnt通路激活因子，其可在不依賴β-catenin蛋白累積的條件下活化Wnt通路而發揮促癌功能。因此，針對RSPO及其受體在乳腺癌中的表達特征及發揮功能的機制，研制特定的靶向藥物或許能為乳腺癌的預后評估及精準個體化治療提供新的策略。然而，目前關于RSPO在乳腺癌中研究結論還缺乏深入的臨床驗證，因此后續開展更多深層次的臨床研究是十分必要的。