Plackett-Burman 聯用響應面法優化酶法-超聲波提取葛根中葛根素工藝

黃佳偉，梁 雁，韋慧鮮，阮碧芳

（廣西農業職業技術大學，廣西 南寧 530000）

葛根系豆科植物野葛（Pueraria lobata（Willd.）Ohwi）的干燥根[1]。研究發現，葛根中含有葛根素、芒果苷、大豆苷、三萜類、香豆素、皂苷等化合物[2]，其中葛根素具有抗氧化、保護肝臟、抗腫瘤等多種藥理作用[3-5]，可用于冠心病、心肌梗死等心腦血管病和糖尿病的治療，具體表現為擴張冠狀動脈，改善心肌缺血，降低血糖以及清除氧自由基等[6-7]。

由葛根制成的相關藥品、保健食品、化妝品已在市場上銷售多年，具有良好的市場基礎。如何從葛根中環保、高效、低成本地提取葛根素是近年的研究熱點[8]。目前，葛根素的提取方法主要有微波法、浸提法、溶劑分離法、乙醇提取法、超聲波提取法等[9-13]，這些提取方法只能在一定程度上利用機械碎裂、熱效應、空化效應的手段破壞葛根細胞壁，存在得率低、浪費提取溶劑的缺點。酶法提取技術高效快速、條件溫和，且能通過破壞植物細胞壁加速細胞內物質溶出，不但能較大程度地提高提取物得率，同時還能保持其原有的功效。

本研究將纖維素酶提取和超聲波提取聯合應用于葛根中葛根素的提取，強化兩種提取方法的優勢，以葛根素得率為評價指標，進一步優化液料比、乙醇體積分數、超聲時間、酶解時間等提取工藝參數，找到更為環保、提取效率更高的葛根素提取方法，為葛根的開發與應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

葛根素標準品（純度≥98%）：上海源葉生物科技公司；乙醇（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；葛根，市售；纖維素酶（50 U/mg）：上海源葉生物科技公司。

1.1.2 儀器與設備

UV-5500 紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；HH-6 數顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；SB-5200D 超聲波清洗儀：寧波新藝超聲設備有限公司；SHB-Ⅲ循環水式真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；FW135 粉碎機：泰斯特儀器有限公司；RE5220 旋轉蒸發儀：常州杰博森儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 葛根素樣品溶液的制備

精密稱取經粉碎并過3 號篩（50 目）的葛根粉末2.5 g，按一定液料比（乙醇∶葛根粉末）加入一定體積分數的乙醇，然后再加入一定質量分數的纖維素酶，50 ℃水浴酶解一定時間，酶解結束后，95 ℃水浴滅活5 min，于30～80 ℃下超聲處理20～70 min，然后進行真空抽濾，并利用旋轉蒸發儀對濾液進行濃縮，用無水乙醇將濃縮液定容至100 mL，即得粗提葛根素樣品溶液。

1.2.2 葛根素含量的測定

1.2.2.1 葛根素標準曲線的繪制

精密稱取葛根素標準品質量20 mg，用乙醇溶解并定容至25 mL 容量瓶中，得到質量濃度為800 μg/mL的葛根素標準品母液，將標準品母液稀釋至1.6、3.2、4.8、6.4、8.0、9.6 μg/mL，分別于250 nm 波長下測定吸光度值。得到葛根素質量濃度（c）與吸光度值（A）的標準曲線方程：A=0.077 3c+0.012（R2=0.999 55）。

1.2.2.2 葛根素得率的計算

精密移取提取樣液，稀釋至適宜濃度，使之在250 nm 吸光度值的線性范圍內，根據標準曲線方程計算葛根素質量濃度，葛根素得率按照以下公式計算。

式中：c為葛根素質量濃度，μg/mL；V為樣品體積，mL；N為稀釋倍數；m為葛根粉的質量，g。

1.2.3 單因素試驗設計

固定液料比30∶1（mL/g）、纖維素酶添加量0.5%、乙醇體積分數50%、酶解時間50 min、超聲時間30 min、超聲溫度60 ℃，分別考察液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g））、纖維素酶添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%）、乙醇體積分數（30%、40%、50%、60%、70%、80%）、酶解時間（30、40、50、60、70、80 min）、超聲時間（20、30、40、50、60、70 min）、超聲溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）對葛根素得率的影響。

1.2.4 Plackett-Burman 試驗設計

結合單因素試驗結果，采用Plackett-Burman 試驗設計，對液料比（A）、纖維素酶添加量（B）、乙醇體積分數（C）、酶解時間（D）、超聲時間（E）、超聲溫度（F）進行關鍵因素的篩選，以葛根素得率作為響應值。每個因素有高低兩個水平。Plackett-Burman 試驗設計因素及水平見表1。

表1 Plackett-Burman 試驗設計因素及水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiment design for puerarin extraction

1.2.5 最陡爬坡試驗

根據Plackett-Burman 試驗結果，篩選出對葛根素得率具有顯著影響的因素，其他非顯著因素條件保持不變，以各因素的效應大小確定爬坡的方向和步長試驗設計[14]，根據葛根素得率的高低確定具有顯著影響因素的最佳提取范圍。

1.2.6 響應面優化試驗設計

根據最陡爬坡試驗結果，固定纖維素酶添加量0.4%，酶解時間70 min，將液料比（A）、乙醇體積分數（B）、超聲時間（C）、超聲溫度（D）設為自變量，葛根素得率設為響應值，利用Box-Behnken 試驗原理，設計四因素三水平的優化試驗。因素及水平編碼如表2所示。

表2 Box-Behnken 響應面試驗因素與水平表Table 2 Factors and levels of Box-Behnken response surface experiments for puerarin extraction

1.2.7 數據處理

采用Excel 2007、Origin 8、Design Expert 11 軟件進行數據分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 液料比對葛根素得率的影響

如圖1 所示，隨著乙醇所占比例的不斷增大，葛根素得率呈現先增加后減少的趨勢，液料比為30∶1（mL/g）時，葛根素得率達到最大值，液料比在30∶1～60∶1（mL/g）時，葛根素得率隨著乙醇所占比例的增大而降低，這可能是乙醇占比的增加，使細胞內外葛根素濃度差變大，葛根素不斷溶出；液料比增大到一定范圍后，其他物質如糖類、蛋白質也相繼擴散出來[15]，形成粘附性膠團附于葛根粉末表面，導致其得率下降。因此，選取液料比20∶1、30∶1、40∶1（mL/g）進行后續篩選試驗。

圖1 液料比對葛根素得率的影響Fig. 1 Effect of liquid-solid ratio on the yield of puerarin

2.1.2 纖維素酶添加量對葛根素得率的影響

酶反應提取作為新型的提取技術，具有高效節能、操作簡單方便、反應溫和的優勢，常用于中成藥有效成分的提取應用[16-17]。如圖2 所示，反應前期，隨著纖維素酶添加量的不斷增加，葛根素得率顯著提高，纖維素酶添加量為0.5%時，葛根素得率達到最大值，而后繼續增加纖維素酶添加量，葛根素得率卻開始降低，原因可能是過多纖維素酶的加入，大量大分子物質如蛋白質等溶出[18]，阻塞了溶出孔，酶解效率降低，導致葛根素得率下降。因此，選擇纖維素酶添加量0.4%、0.5%、0.6%進行后續篩選試驗。

圖2 纖維素酶添加量對葛根素得率的影響Fig. 2 Effect of cellulase adding amount on the yield of puerarin

2.1.3 乙醇體積分數對葛根素得率的影響

如圖3 所示，反應前期，隨著乙醇體積分數的升高，葛根素得率不斷提高，乙醇體積分數為50%時，葛根素得率達到最大值，之后葛根素得率呈下降趨勢，原因是隨著乙醇體積分數的增加，葛根粉中其他可溶于乙醇的成分如極性小分子也在不斷溶出，與葛根素競爭溶劑，使其溶出受限。因此，選擇乙醇體積分數40%、50%、60%進行后續篩選試驗。

圖3 乙醇體積分數對葛根素得率的影響Fig. 3 Effect of ethanol content on the yield of puerarin

2.1.4 酶解時間對葛根素得率的影響

如圖4 所示，葛根素得率隨著酶解時間的延長呈現先升高后降低的變化趨勢。在酶解時間為60 min時，葛根素得率達到最大值，之后隨著酶解時間的延長，葛根素得率反而降低，原因可能是當酶解時間過長時，酶解底物過多，酶反應趨于穩定[19]；隨著葛根細胞壁破裂，黏性物質釋放，致使葛根素溶出受阻。因此，選擇酶解時間50、60、70 min 進行后續篩選試驗。

圖4 酶解時間對葛根素得率的影響Fig. 4 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of puerarin

2.1.5 超聲時間對葛根素得率的影響

如圖5 所示，反應前期，隨著超聲時間的延長，葛根素得率不斷提高，在40 min 時達到最大值，隨后葛根素得率下降，原因可能是超聲時間過長，引起細胞空間構型改變[20]，葛根素溶出受限，導致其得率下降。因此，選擇超聲時間30、40、50 min 進行后續篩選試驗。

圖5 超聲時間對葛根素得率的影響Fig. 5 Effect of ultrasonic time on the yield of puerarin

2.1.6 超聲溫度對葛根素得率的影響

如圖6 所示，反應前期，隨著超聲溫度的升高，葛根素得率不斷提高，超聲溫度為60 ℃時，葛根素得率達到最大值，之后葛根素得率反而不斷下降。原因可能是超聲溫度過高時，葛根素部分結構受到破壞，導致葛根素得率下降。因此，選擇超聲溫度50、60、70 ℃進行后續篩選試驗。

圖6 超聲溫度對葛根素得率的影響Fig. 6 Effect of ultrasonic temperature on the yield of puerarin

2.2 Plackett-Burman 試驗結果

根據單因素試驗結果，以葛根素得率為響應值，采用Plackett-Burman 法進行顯著因素篩選試驗。試驗設計及結果見表3，對試驗結果進行方差分析及顯著性檢驗，結果見表4。由表4 可知，模型的F 值=24.97＞1，P 值＜0.01，R2=0.96 7=0.929，表明模型設計合理；6 個因素對葛根素得率的影響程度大小為：A＞E＞C＞F＞D＞B；液料比（A）、乙醇體積分數（C）、超聲時間（E）、超聲溫度（F）對葛根素得率影響顯著（P＜0.05），纖維素酶添加量（B）和酶解時間（D）對葛根素得率影響不顯著。

表3 Plackett-Burman 試驗設計及結果Table 3 Plackett-Burman experiment design and results

表4 Plackett-Burman 試驗統計分析Table 4 Statistical analysis of Plackett-Burman test

對表3 數據進行回歸分析，得到6 個因素和響應值葛根素得率的多元一次回歸方程：Y=7.53+0.76A-0.056B+0.19C+0.072D-0.22E-0.19F。從方程可知：在顯著性因素中，液料比和乙醇體積分數為正效應，即隨著取值的增大，葛根素得率呈升高趨勢；超聲時間和超聲溫度為負效應，即隨著取值的增大，葛根素得率為降低趨勢。在非顯著性因素中，纖維素酶添加量為負效應，應取其低水平，酶解時間為正效應，應取其高水平。

因此，在后續試驗中，固定纖維素酶添加量0.4%，酶解時間70 min。選擇液料比、乙醇體積分數、超聲時間、超聲溫度4 個因素進一步考察，分析這4 個因素及其相互作用對葛根素得率的影響。

2.3 最陡爬坡試驗結果

由表5 可知，隨著液料比（A）和乙醇體積分數（C）逐漸增大，超聲時間（E）和超聲溫度（F）逐漸減小，葛根素得率呈先升高后降低的趨勢。試驗組3 的葛根素得率最大，因此，選取試驗組3 作為響應面試驗的中心點。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果Table 5 Design and results of the steepest climbing test

2.4 響應面試驗結果

2.4.1 響應面試驗設計與結果及方差分析

根據最陡爬坡試驗結果，采用Box-Behnken 設計原理，將4 個自變量設計成四因素三水平共29 組試驗，響應面試驗結果見表6。

使用Design Expert 11 軟件對表6 的試驗結果進行數據處理，將葛根素得率作為響應值，與各個因素進行回歸擬合，得到二次多項回歸方程為：Y=8.73 +0.14A +0.3B -0.27C +0.14D -0.21AB +0.1AC -0.42AD-0.078CD-0.88A2-0.66B2-0.19C2-0.32D2。方差分析結果見表7。

表6 Box-Behnken 試驗設計方案及結果Table 6 Box-Behnken experiment design and results

由表7 可知，模型P＜0.000 1，模型可信度高，同時失擬項不顯著（P=0.123 2）＞0.05，說明該方程擬合合理，模型可用于實際值的預測。B、C、AD、A2、B2、D2對響應值的影響極顯著（P＜0.01），A、D、AB、C2對響應值的的影響顯著（P＜0.05）。以上結果說明：乙醇體積分數和超聲時間是影響葛根素提取的2 個主要因素，液料比和超聲溫度次之；液料比與乙醇體積分數、液料比與超聲溫度的交互作用對葛根素的得率有顯著影響（P＜0.05），其他因素交互作用的P 值均大于0.05，對葛根素的得率無顯著影響。回歸方程的R2=0.957 4，=0.914 7，說明該模型可以用于解釋91.47%響應值的變化，即模型與實際試驗擬合程度較好，可在該模型基礎上進行試驗因素條件優化，用于預測葛根素的最優提取工藝。

表7 Box-Behnken 試驗回歸方程方差分析表Table 7 Analysis of variance of regression equation for Box-Behnken test

2.4.2 響應面圖形分析

響應面圖的坡度顯示了因素對響應值的影響，坡度越陡峭，即傾斜度越大，表明兩個因素之間的交互作用對響應值的影響越顯著。對比響應面圖的坡度陡緩趨勢可知（圖7），乙醇體積分數（B）對葛根素得率影響較大，其次是超聲時間（C）和超聲溫度（D），液料比（A）的響應面曲面相對平緩，說明液料比對葛根素得率影響相對較小。乙醇體積分數（B）與液料比（A）之間的交互作用對葛根素得率影響顯著（P＜0.05），當乙醇體積分數較小時，液料比對葛根素得率影響較大，隨著液料比的增大，葛根素得率快速升高，而乙醇體積分數增大后，葛根素得率又降低；液料比（A）與超聲時間（C）的交互作用對葛根素得率影響不顯著，隨著液料比增大和超聲時間的延長，葛根素得率出現先升高后降低的趨勢；液料比（A）與超聲溫度（D）的交互作用對葛根素得率影響極顯著（P＜0.01），葛根素得率呈現先升高后降低的趨勢；乙醇體積分數（B）與超聲時間（C）的交互作用對葛根素得率的影響不顯著，隨著乙醇體積分數升高和超聲時間延長，葛根素得率呈現先升高后降低的趨勢；乙醇體積分數（B）與超聲溫度（D）的交互作用對葛根素得率的影響不顯著，葛根素的得率隨著乙醇體積分數和超聲溫度的升高呈現先提高后降低的趨勢；超聲溫度（D）與超聲時間（C）的交互作用對葛根素得率影響不顯著，葛根素得率呈現先提高后降低的趨勢。

圖7 各因素間的交互作用對葛根素得率影響的響應面圖Fig. 7 Response surface diagram of the effects of factors interaction on the yield of puerarin

2.5 葛根素提取最佳工藝條件的預測及驗證試驗

經過Plackett-Burman 試驗、最陡爬坡試驗，最后由Box-Behnken 試驗預測得到，在固定纖維素酶添加量0.4%，酶解時間70 min 的情況下，葛根素提取的最佳工藝條件為：液料比29.13∶1（mL/g），乙醇體積分數52.41%，超聲時間31.78 min，超聲溫度63.82 ℃。在上述條件下模型預測的葛根素得率為8.89 mg/g。為了便于實際操作，將提取條件修正為：液料比30∶1（mL/g），乙醇體積分數52%，超聲時間31 min，超聲溫度64 ℃。按照修訂后條件進行3 次驗證試驗，葛根素平均得率為8.78 mg/g，與理論預測值僅有1.23%的誤差，數據重復性較好，證實Design Expert 11 軟件構建的以葛根素得率為響應值的模型是有效可靠的。

3 結論

中成藥中有效成分的藥效保留主要取決于對中成藥原藥的提取、分離、純化技術，而傳統的提取方法已無法滿足中成藥提取后藥物質量控制的要求，這也是阻礙中成藥實現藥物現代化的原因之一。本研究通過纖維素酶對植物細胞壁酶解的特點，在超聲波輔助的溫和條件下，通過Plackett-Burman 試驗篩選出影響顯著的因素，從最陡爬坡試驗得出最大響應值區域，并將其作為Box-Behnken 響應面法的分析中心點，進行四因素三水平的響應面試驗，通過優化及驗證試驗，確定提取葛根中葛根素的最佳工藝參數為：液料比30∶1（mL/g），乙醇體積分數52%，超聲時間31 min，超聲溫度64 ℃。在該工藝條件下，葛根素平均得率為8.78 mg/g，與理論值基本相符，表明采用Box-Behnken 響應面法優化從葛根中提取葛根素的工藝是可行的。