褪黑素浸種對混合鹽堿脅迫下藜麥生長及生理的影響

李平平，張永清，，張 萌，馬星星，薛小嬌，張文燕，王 茹，梁 萍，王 丹，趙 剛

(1.山西師范大學生命科學學院，山西太原 030000； 2.山西師范大學地理科學學院，山西太原 030000)

土壤鹽漬化會引起土壤物理性質的惡化，直接危害作物生長甚至生存，導致農業綜合產能下降，嚴重制約農業發展，造成大面積土壤資源難以利用[1]。山西省位于黃土高原東緣，耕地大多集中在一系列盆地之中，盆地有灌溉之利，是山西省重要的糧食生產基地[2]。但由于盆地中地形、水文、氣候等天然因素及系統不健全，使得土壤鹽漬化問題較為嚴重，造成農作物大幅度減產[3]。目前，常見的鹽堿地的改良措施包括水利、物理、化學和生物改良措施等[4]。但由于鹽堿地的土壤障礙因素繁雜，導致其改造困難且周期漫長[5]。前人研究表明，在眾多措施中，改變(或選擇)作物以適應環境，如通過引種、篩選和種植耐鹽作物，采用化學調控措施如施用外源化合物處理種子以提高其抗鹽堿性[6]以及躲鹽巧種等，是改善和利用鹽堿土耕地資源措施中最具生態效益和經濟效益的方法[7]，往往可以起到事半功倍的效果。

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)為一年生莧科藜亞科藜屬雙子葉植物。近年來，藜麥因其豐富全面的營養價值與良好的食療功效受到越來越多追求健康飲食人們的青睞[8-9]。另外，因大多數藜麥品種具有較強的抗逆性，可在干旱、鹽堿、低溫、瘠薄等多種逆境中生長[10]而使得其在鹽堿、干旱及冷涼區具有明顯區位優勢，有望成為這些地區脫貧致富的關鍵農作物。盡管近年來國內外諸多學者在探究藜麥營養價值、食品功能性及抗逆性上取得了一些重要進展，但有關如何進一步提高藜麥耐鹽堿性的研究仍有待加強。

褪黑素(melatonin，MT)化學名稱為N-乙酰-5-甲氧基色胺。作為一種新興植物生長調節物質，褪黑素被認為是天然抗氧化劑。已有研究表明，褪黑素能夠通過提高非生物脅迫下植物中抗氧化酶活性和抗氧化劑含量，清除過量活性氧自由基和體內多種活性氧，緩解脅迫對膜系統造成的損害[11]，進而起到緩解逆境脅迫的效果，尤其是能顯著緩解鹽堿脅迫[12-14]、低溫或高溫脅迫[15-18]、干旱脅迫[19]等對植物造成的損害。但有關外源褪黑素調控藜麥耐鹽堿性的相關研究鮮有報道。因此，本研究以不同耐鹽堿性藜麥為試驗材料，探索分析了褪黑素浸種對混合鹽堿脅迫下不同耐鹽堿性藜麥植株的生長及生理特征的影響，旨在篩選出最適褪黑素浸種濃度，探究通過褪黑素來提高藜麥耐鹽脅迫能力的生理機制，以期為藜麥生產過程中利用褪黑素來強化藜麥耐鹽性和揭示褪黑素增強藜麥耐鹽性機制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用經抗性鑒定的2個耐鹽堿能力不同的藜麥品種[20]：隴藜3號(鹽堿敏感品種)和隴藜4號(耐鹽堿品種)為供試品種。試驗所用種子均由甘肅省農業科學院畜草與綠色農業研究所魏玉明老師提供，褪黑素(分析純)購自山西艾科實驗室設備有限公司。

1.2 試驗設計

試驗設置了不同耐鹽堿性藜麥品種(L3、L4)和褪黑素濃度(0.75、150、300 μmol/L)2個因素，共設置10個處理：L3CK(隴藜3號+正常土壤+蒸餾水)、L3MT0(隴藜3號+鹽堿脅迫土壤+蒸餾水)、L3MT75(隴藜3號+鹽堿脅迫土壤+75 μmol/L MT)、L3MT150(隴藜3號+鹽堿脅迫土壤+150 μmol/L MT)、L3MT300(隴藜3號+鹽堿脅迫土壤+300 μmol/L MT)、L4CK(隴藜4號+正常土壤+蒸餾水)、L4MT0(隴藜4號+鹽堿脅迫土壤+蒸餾水)、L4MT75(隴藜4號+鹽堿脅迫土壤+75 μmol/L MT)、L4MT150(隴藜4號+鹽堿脅迫土壤+150 μmol/L MT)、L4MT300(隴藜4號+鹽堿脅迫土壤+300 μmol/L MT)。采用隨機設計，每處理重復8次，共計80盆。

混合鹽堿脅迫條件的設計：試驗選擇2種中性鹽 (NaCl、Na2SO4)和1種堿性鹽(NaHCO3)，參照文獻[3]以晉南地區中度鹽堿地0～20 cm土壤全鹽量以及硫酸鹽氯化物草甸鹽土的鹽分組成為依據進行鹽分配比，確定試驗所需各鹽堿比例(NaCl ∶Na2SO4∶NaHCO3質量比為5 ∶4 ∶1)，并按此鹽堿比計算各種鹽所需用量，分別稱量后裝入自封袋備用。以直徑40 cm、高30 cm的黑色無孔營養缽作為試驗用盆，進行藜麥盆栽試驗。栽培基質為過篩風化土與細沙體積比為1 ∶1的混合物，混合均勻后裝入營養缽，每缽裝基質17 kg。每缽施入等量的氮、磷、鉀肥作為肥底，1 kg基質用量分別為 0.15 g N、0.20 g P2O5、0.15 g K2O，NaCl、Na2SO4、NaHCO3以及氮、磷、鉀肥與栽培基質攪拌均勻裝入營養缽內。

試驗在山西師范大學室外防雨棚內進行。選取健康飽滿均勻的藜麥種子，用質量分數為3%的H2O2溶液消毒15 min，蒸餾水反復沖洗直至干凈。之后將種子分別置于盛有不同濃度褪黑素溶液的燒杯中，浸種8 h，CK和MT0組以等量蒸餾水浸種。浸種完成后所有處理適時常規播種。試驗期間采用稱量法澆水，保持土壤水分在田間持水量的60%～75%。為防止自上而下灌水導致土壤施入鹽分集中到盆底無法模擬現實鹽堿地的土壤鹽分分布，本研究在營養缽內放入聚氯乙烯(PVC)管作注水管，管下端斜切，插入用紗布包裹的石子中，以保證水分正常注入缽底，從而實現自下而上灌水，試驗期間2種灌水方式交替進行。所有栽培管理措施中，除褪黑素處理不同外，其他條件均保持一致。4葉1心時期定苗，每缽留長勢一致、均勻分布的藜麥苗5株。于顯穗期測定藜麥相關指標。

1.3 測定項目與方法

用米尺測植株高度、用游標卡尺測其莖粗，從根莖結合部將地上部和根系分開，分別進行取樣。取樣期間進行完整的根系采集，采用Delta-T SCAN植物根系分析系統測定根系總長度、表面積、體積[21]。將地上部和根系樣品放入烘箱，105 ℃下殺青 30 min，80 ℃ 下烘至恒質量，烘干后立即用電子天平分別稱量并記錄。取植株自上向下第2張新展開葉片，用手持SPAD值葉綠素儀測定葉綠素含量，用葉面積儀測定其葉面積。參照高俊鳳的方法[22]測定根系活力；參照李合生的方法[23]測定葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性和過氧化物酶(POD)活性；采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附法(ELISA)，用酶標儀 (Rayto RT-6100型)和谷胱甘肽還原酶(GR)的ELISA檢測試劑盒測定谷胱甘肽還原酶(GR)活性水平[24]。

采用Microsoft Excel 2010 軟件進行數據整理，利用SPSS 22.0 軟件進行方差分析，并用Duncan’s法進行多重比較。采用Origin 2018進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 褪黑素浸種對混合鹽堿脅迫下藜麥生長的影響

2.1.1 褪黑素浸種對混合鹽堿脅迫下藜麥地上部生長的影響 由表1可知，混合鹽堿脅迫對2個品種藜麥地上部(MT0)的生長均有顯著影響(P<0.05)，表現為鹽堿敏感品種L3和耐鹽堿品種L4的株高、莖粗和葉面積與 CK相比分別降低了30.00%、23.99%、30.56%和38.73%、5.66%、12.49%。混合鹽堿脅迫下，對于耐鹽堿品種L4而言，其株高、莖粗和葉面積均呈現隨著褪黑素濃度的增大先升后降的趨勢，且各指標均在MT150處理達到峰值，與MT0相比各指標的增幅分別為25.13%、17.60%、22.32%，超過最適褪黑素濃度各指標開始下降。對于鹽堿敏感品種L3而言，其株高、莖粗和葉面積隨褪黑素濃度的增大而逐漸升高，于MT300處理達到最大值，分別比MT0高52.70%、73.73%、48.18%。以上結果表明，褪黑素浸種可以緩解藜麥在混合鹽堿條件下的受脅迫程度，使植株地上部營養器官更好生長，但相同濃度褪黑素對2個品種的緩解效果不同。

表1 褪黑素浸種對混合鹽堿脅迫下藜麥地上部的影響

2.1.2 褪黑素浸種對混合鹽堿脅迫下藜麥根系生長的影響 由表2可知，鹽堿脅迫下L3的總根長度、根系體積和根系表面積均表現為MT300>MT150> MT75>MT0，與CK相比，混合鹽堿脅迫處理誘導L3的上述3個指標(MT0)，分別顯著降低30.10%、44.35%、42.50%(P<0.05)。各褪黑素處理中 300 μmol/L濃度下L3的總根長度、根系體積、根系表面積顯著增加分別為MT0的1.2、1.8、1.7倍。耐鹽堿品種L4的各處理中，MT0與CK相比，總根長度、根系體積、根系表面積分別顯著降低29.12%、28.70%、12.54%(P<0.05)，脅迫處理中藜麥根系上述3項指標均表現為MT150>MT300>MT75>MT0，其中 150 μmol/L褪黑素浸種后L4的總根長度、根系體積、根系表面積顯著增加分別為MT0的1.4、1.5、1.2倍。由此可見，混合鹽堿脅迫對不同耐鹽堿性藜麥根系生長的脅迫程度不同，褪黑素可以通過增加根系的總根長、體積和表面積，增大根系吸收面積以保證在土壤中吸收更多水分和營養物質，從而維持藜麥在鹽堿脅迫環境下的正常生長。

由圖1可知，混合鹽堿脅迫下，2個品種藜麥(MT0)的側根數均顯著低于CK，分別下降了39.16%、37.6%。L4的側根數呈隨著褪黑素濃度的增大呈先升后降的變化趨勢，在MT150處理時達到峰值；各濃度褪黑素處理與MT0相比均有所增加，增幅分別為12.82%、55.13%、39.74%。L3的側根數隨褪黑素濃度的增大呈逐漸升高的趨勢，與MT0相比，MT75、MT150、MT300增幅分別為9.59%、60.27%、65.75%。2個品種藜麥的MT150、MT300處理與MT0間均達到顯著性差異(P<0.05)。由此可見，褪黑素能刺激混合鹽堿脅迫下藜麥側根的生長，增大根系的吸收面積，吸收更多養分以緩解鹽堿脅迫帶來的危害。

表2 褪黑素浸種對混合鹽堿脅迫下藜麥根系生長的影響

2.1.3 褪黑素浸種對混合鹽堿脅迫下藜麥植株干質量的影響 由圖2可知，與CK相比，混合鹽堿脅迫顯著降低了2個品種藜麥(MT0)的地上部及根系干質量，降幅分別為48.72%、33.70%(L3)和38.46%、22.02%(L4)，鹽堿敏感品種的降幅大于耐鹽堿品種，并且混合鹽堿脅迫對地上部干質量積累的影響大于根系。混合鹽堿脅迫下，L4的地上部及根系干質量隨著褪黑素濃度的增大呈現出先升后降的變化趨勢，且二者均在MT150處理達到峰值，與MT0相比增幅達到70.24%、24.83%，MT0與MT150、MT300處理間均存在顯著性差異。L3則呈現出隨褪黑素濃度的增大地上部及根系干質量逐漸升高的變化趨勢，且均在MT300達到最大值，與MT0相比增幅分別為121.05%、37.22%，各褪黑素處理均與MT0處理存在顯著差異(MT75地上部干質量除外)。由此可見，褪黑素浸種處理對于緩解混合鹽堿脅迫條件下藜麥干物質的積累減少有明顯效果，其中對地上部的緩解作用要大于對根系的緩解作用。

2.2 褪黑素浸種對混合鹽堿脅迫下藜麥生理的影響

2.2.1 褪黑素浸種對混合鹽堿脅迫下藜麥葉片抗氧化酶活性的影響 由圖3可知，與CK相比，混合鹽堿脅迫導致2個品種藜麥葉片(MT0)的SOD、POD和GR活性均顯著下降(P<0.05)，這可能是由于鹽堿脅迫時間較長，藜麥葉片內的活性氧積累過多，超出藜麥自身抗氧化酶類系統的清除范圍，導致該系統的清除活性氧能力減弱或喪失。各褪黑素處理可不同程度提高藜麥葉片的 SOD、POD和GR活性。L3的3種抗氧化物酶活性均表現為 300 μmol/L 處理的酶活性最高，150 μmol/L濃度次之，75 μmol/L濃度處理最低；SOD、POD、GR活性和MT0相比，最大增幅分別可達54.15%、48.27%和126.95%。L4品種的SOD、POD和GR活性則是以150 μmol/L處理的最高，300 μmol/L次之，75 μmol/L 濃度處理最低；與MT0相比SOD、POD增幅達到50.34%和38.94%，GR活性在150 μmol/L浸種濃度下達到峰值，為2.92 U/g。以上結果表明，褪黑素浸種可以有效提高混合鹽堿脅迫下2個品種藜麥葉片的SOD、 POD以及GR活性，增強藜麥葉片活性氧的代謝能力，清除自由基和活性氧，緩解氧化傷害以增強藜麥抗鹽堿性，更加適應不良生境。

2.2.2 褪黑素浸種對混合鹽堿脅迫下藜麥根系活力和葉片葉綠素含量的影響 由圖4-a可知，混合鹽堿脅迫顯著降低了2個品種藜麥的根系活力，與CK相比MT0的降幅分別為37.33%(L3)、27.30%(L4)，L3降幅大于L4。與鹽堿脅迫處理相比，褪黑素浸種處理顯著提高了藜麥的根系活力，表現為L3的根系活力隨褪黑素濃度的增大呈現出逐漸上升的變化趨勢，在MT300處理達到峰值，與MT0相比增幅為60.14%，各褪黑素處理間差異顯著。L4的根系活力則呈現出先升后降的變化趨勢，在MT150處理達到最大值，相對于MT0其根系活力升高了32.79%，各褪黑素處理間差異顯著。由此可見，褪黑素浸種可以有效提高混合鹽堿脅迫下藜麥根系活力，促進根系吸收營養物質及水分以增強其抗鹽堿性。

由圖4-b可知，混合鹽堿脅迫顯著影響了2個品種藜麥葉片的葉綠素含量，與CK相比，L3和L4 MT0的葉綠素含量分別顯著降低了15.72%和14.54%。經不同濃度褪黑素浸種處理后，鹽堿敏感品種L3的葉綠素含量隨褪黑色素濃度的增大而上升，在褪黑素濃度為300 μmol/L時達到最大值，與MT0處理相比，葉綠素含量增加18.72%，MT0與MT75處理無顯著差異，與MT150和MT300處理差異顯著。耐鹽堿品種L4葉綠素含量則是隨褪黑素濃度升高呈現出先升后降的變化趨勢，與MT0相比，當褪黑素濃度為150 μmol/L時葉綠素含量增加12.36%，而當褪黑素濃度繼續升高時葉綠素含量降低，MT0與MT75處理無顯著差異，與MT150和MT300處理差異顯著。以上結果表明，混合鹽堿脅迫使藜麥葉片的葉綠素含量降低，而褪黑素的施用在一定程度上提高了混合鹽堿脅迫下葉綠素的含量，緩解了由混合鹽堿脅迫引起的光合抑制。不同濃度褪黑素對于不同耐鹽堿性藜麥葉片葉綠素降解的緩解效果不同。

3 討論與結論

前人研究表明，單一中性鹽脅迫已對植物生長甚至生存構成重大威脅，混合鹽堿脅迫生境下，植物更是遭受遠高于單一中性鹽脅迫的不可逆損傷[29]。褪黑素既可以作為一種信號分子，又可作為一種抗氧化分子[30]，褪黑素的作用效果與劑量有直接關系，最適濃度褪黑素可抵抗環境脅迫，但植物種類不同，其最適濃度也不同[31]。200 μmol/L褪黑素處理能促進復合鹽堿脅迫和堿性鹽脅迫下越橘的生長，增加葉片光合色素含量，提高其光合能力，同時能通過增強葉片結構增強其耐鹽堿性[32]。以 10 μmol/L 褪黑素浸種棉花幼苗后，其對鹽脅迫環境的適應性有所提高[33]。本研究試驗條件下，對同一種植物的不同抗性品種而言，其最適褪黑素浸種濃度也有所不同，鹽堿敏感品種L3的最適褪黑素浸種濃度為300 μmol/L、耐鹽堿品種L4的最適褪黑素浸種濃度為150 μmol/L。

生長狀況是作物對于鹽堿脅迫的綜合反映，也是作物抗鹽堿性最優的評價指標。鹽堿脅迫會抑制作物株高和莖粗，對營養生長有明顯抑制作用[34]。本研究中，混合鹽堿脅迫導致2個品種藜麥的株高、莖粗、葉面積及生物量均顯著下降，經褪黑素浸種處理的2個不同耐鹽堿性品種藜麥在混合鹽堿脅迫下上述4個指標的下降趨勢均得到有效緩解，這與李陽等報道外源褪黑素有效促進鹽脅迫下棉花幼苗株高生長的變化趨勢[35]基本一致；與張娜等報道褪黑素促進狼尾草干物質積累結論[36]相類似，表明褪黑素浸種可能通過促進逆境下藜麥地上部的生長，以積累更多有機物進而維持藜麥正常的生長發育。

作物根系形態結構能直接反映出作物生長發育水平及作物對土壤水分和礦質元素的吸收能力[37]。在脅迫條件下，根系往往是直接或者首要的受害部位，其根長、分枝及根毛的多少都會使其對土壤水分及養分吸收能力的強弱造成直接影響，較長的根長、較強的根系活力、較大的根表面積和根體積都有助于作物吸收利用水分和養分[38-39]。本研究中，混合鹽堿脅迫下，2個品種藜麥根系的側根數、總根長度、表面積、體積以及根系活力都顯著降低，褪黑素浸種處理則明顯提高了上述根系指標，其中300 μmol/L的褪黑素對隴藜3號緩解效果最好，150 μmol/L褪黑素對隴藜4號緩解效果最好。褪黑素能夠誘導根系生長受生長素調節過程的調控，影響根系對水分的吸收，啟動細胞壁不可修復的延伸[31]。另外，褪黑素浸種促進了藜麥側根數目的增加，是由于5HT作為褪黑素合成前體，并非增強根系側根的萌發效應，而是與 IAA 形成了拮抗作用，抑制根系的頂端優勢，增加了側根數目[40]。本研究結果與聶必林等報道褪黑素有效促進復合鹽堿脅迫下黑果枸杞幼苗芽長、根長生長及側根數目增加的變化趨勢[41]相似，與付晴晴等報道的褪黑素能夠提高NaHCO3脅迫下葡萄根系活力的研究結果[42]一致。表明褪黑素可能通過促進根系的形態發育，增大其吸收面積，提高根系活力，增強根系對營養物質的吸收、轉運、積累和利用，從而保證作物在鹽堿脅迫下正常生長。

葉綠素是植物進行光合作用的功能色素，其含量多少會影響植物的光合生理。鹽脅迫會影響植物葉片內葉綠素的代謝過程，導致葉綠素的合成量減少，加快葉綠素的降解[43]。本研究中混合鹽堿脅迫導致2個品種藜麥葉片的葉綠素含量都顯著降低，褪黑素浸種處理不同程度的增加了2個品種藜麥葉片的葉綠素含量，這與鹽脅迫條件下施用褪黑素抑制番茄葉綠素降解，維持其后期葉綠素含量的研究結果[44]相似。因此，適宜濃度褪黑素浸種可以有效緩解鹽堿脅迫下葉片葉綠素的降解，有助于增強作物的光合作用，提高對逆境的適應性。

逆境常迫使植物體內產生過多的活性氧，致使自由基積累過量、加劇膜脂過氧化、細胞內蛋白質與重要酶類失活分解等一系列不良反應的發生，危及植物的生長發育[43，45-47]。抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循環是植物體內清除活性氧(ROS)的重要途徑。谷胱甘肽還原酶是此途徑中的關鍵酶，催化氧化態的谷胱甘肽(GSSG)還原生成還原態的谷胱甘肽(GSH)維持植物體內的GSH含量和GSH庫的氧化還原狀態并清除ROS。GR對植物體內ROS的清除、維持GSH的含量、保持細胞的谷胱甘肽庫的氧化還原狀態(GSSG/GSH)作用極大[48]。SOD作為膜保護的首道防線，可以清除超氧陰離子，轉變為氧化能力極強的羥自由基[49]。本研究發現，混合鹽堿脅迫下兩品種藜麥葉片的SOD、POD、GR活性均降低，這與趙穎等隨著脅迫程度的增加抗氧化酶活性顯著降低的結論[7，26]相似；這可能是由于鹽堿脅迫時間較長，致使藜麥體內鹽含量過度積累，已超過藜麥自身抗氧化系統的清除閾值，導致抗氧化物酶活性降低，說明藜麥清除活性氧和自由基的能力減弱，保水能力下降。外源褪黑素能提高植物的抗氧化酶活性，清除植物體內活性氧[50]。本研究發現，除褪黑素濃度為75 μmol/L時，2個品種藜麥的SOD活性與鹽堿單獨脅迫處理差異不大，其他褪黑素處理均可顯著提高混合鹽堿脅迫下2個品種藜麥的SOD、POD、GR活性。這說明外源褪黑素可能參與混合鹽堿脅迫下藜麥抗氧化酶系統清除活性氧的調控，增強植株對鹽堿傷害的防御能力。

混合鹽堿脅迫抑制了2個品種藜麥的生長和生理過程。本研究中，混合鹽堿脅迫對鹽堿敏感品種隴藜3號藜麥的生長及生理的抑制作用強于耐鹽堿品種隴藜4號；褪黑素浸種對混合鹽堿脅迫下鹽堿敏感品種隴藜3號的緩解效果要優于耐鹽堿品種隴藜4號。褪黑素浸種可通過促進地上部和根系的形態生長、刺激側根發育、減少葉綠素降解、增加地上部和根系的干物質積累、提高根系活力、提高SOD、POD、GR等抗氧化酶活性，從而緩解混合鹽堿對生長和生理的抑制，進一步增強藜麥的耐鹽堿能力。在本試驗條件下，300 μmol/L褪黑素浸種對鹽堿敏感品種隴藜3 號耐鹽堿性的提高效果最佳，150 μmol/L 褪黑素浸種對耐鹽堿品種隴藜4 號耐鹽堿性的提高效果最佳。