叢枝菌根真菌與綠色木霉對(duì)干旱脅迫下蘋果樹苗生長(zhǎng)、生理特征及水分利用的影響

王 建，趙 單

(1.河南林業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南洛陽 450002； 2.湖南省農(nóng)林工業(yè)勘察設(shè)計(jì)研究總院，湖南長(zhǎng)沙 410007)

水資源短缺帶來的干旱脅迫是目前影響植物完成生長(zhǎng)史過程中最為嚴(yán)重的全球性問題。研究表明，干旱脅迫可通過破壞植物的養(yǎng)分吸收、光合作用和細(xì)胞代謝等多種生理生化過程，嚴(yán)重影響作物的生長(zhǎng)發(fā)育和生產(chǎn)力[1]。干旱脅迫會(huì)誘導(dǎo)大量活性氧累積，從而損害植物細(xì)胞，為應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激，植物可通過調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)以減輕甚至消除活性氧(ROS)，超氧化歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等酶可有效減輕ROS累積，從而減輕細(xì)胞膜中脂質(zhì)過氧化帶來的損傷，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性[2]。在真核生物中，SOD分為Cu/Zn-SOD、Fe-SOD和Mn-SOD，Cu/Zn-SOD主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，F(xiàn)e-SOD和Mn-SOD分別位于葉綠體和線粒體中[3]。CAT是含有血紅素的四聚體酶，可將H2O2直接分解為H2O和O2，這是植物在脅迫條件下清除活性氧的必要條件[4]；因此，干旱脅迫下植物中抗氧化酶特征可以反映植物耐受土壤水分虧缺的能力。

除了抗氧化酶，植物還具備其他減輕氧化損傷的策略，例如根系可與土壤中的叢枝菌根(AM)真菌互利互惠，從而減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[5]。AM真菌是植物根際有益的土壤微生物，它可以與絕大多數(shù)陸生植物根形成共生叢枝菌根共生結(jié)構(gòu)。AM真菌可以直接或間接幫助植物獲取土壤中的養(yǎng)分和水分，作為回報(bào)宿主植物提供脂肪酸為主的碳酸化合物以維持AM真菌的繁衍與生長(zhǎng)[6]。目前的研究表明，AM真菌不僅可為宿主植株提供養(yǎng)分資源，同時(shí)也可協(xié)助植物應(yīng)對(duì)生物/非生物脅迫。胡振興等研究表明，干旱脅迫下AM真菌可有效提高大豆葉片超氧化物歧化酶(SOD)及過氧化物酶(POD)活性，增加土壤磷酸酶、蔗糖酶和脲酶活性，影響土壤微生物群落組成[7]。此外，干旱脅迫下接種AM真菌均顯著提高了玉米葉水勢(shì)、降低脯氨酸含量、提高葉片保護(hù)酶(SOD、POD)活性，降低玉米丙二醛(MDA)積累，從而減輕玉米葉片膜脂過氧化帶來的損傷[8]。

綠色木霉(Trichodermaviride)是一種重要的多功能型絲狀真菌，其代謝產(chǎn)物種類豐富、活性物質(zhì)多樣，在農(nóng)業(yè)、林業(yè)領(lǐng)域及生態(tài)保護(hù)領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用[9]。以往的研究表明，干旱脅迫下接種綠色木霉真菌可以促進(jìn)植物地上部農(nóng)藝性狀及根系生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)的生理代謝來誘導(dǎo)宿主的抗逆性[10]。前人研究表明，綠色木霉與枯草芽孢桿菌進(jìn)行番茄灌根后可以有效改善幼苗根系形態(tài)、增加根投影面積，并提高土壤中銨態(tài)氮、有效磷和速效鉀含量，從而促進(jìn)番茄植株生長(zhǎng)[11]。鄧薇等研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下綠色木霉可促進(jìn)玉米幼苗根系形態(tài)指標(biāo)、根系構(gòu)型以及根系幾何特征指標(biāo)，從而緩解干旱脅迫對(duì)玉米幼苗根系帶來的不利影響[12]。目前關(guān)于AM真菌或木霉真菌應(yīng)用于病蟲害及重金屬脅迫的研究已被廣泛報(bào)道，然而對(duì)非生物脅迫(如干旱脅迫)的研究較少，且主要是單一接種，較少涉及組合施用效果。基于此，本研究通過分析正常水分和干旱條件下接種AM真菌、綠色木霉及其組合處理對(duì)蘋果樹幼苗生長(zhǎng)發(fā)育、水分利用、光合特性及氧化系統(tǒng)特征的差異，以期為微生物技術(shù)運(yùn)用于果樹栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2021年3—6月于河南林業(yè)職業(yè)學(xué)院遮雨場(chǎng)地中進(jìn)行。供試蘋果樹為煙富6號(hào)，種子來自河南省鄭州果樹研究所，采用育苗缽培養(yǎng)至6～7葉齡。

叢枝菌根真菌接種菌劑為摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)，購自北京農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所，試驗(yàn)接種物由孢子(105個(gè)/g土)、菌絲和土壤基質(zhì)組成。綠色木霉(Trichodermaviride)來自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所，保存于中國普通微生物保藏管理中心(保藏編號(hào)：CGMCC 5.1249)，接種菌劑為PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)-恒溫?fù)u床增殖的懸濁液[9]。

試驗(yàn)地土壤類型為中壤土，采用0～20 cm表層土，土壤采用濕熱滅菌處理(121 ℃，1×105kPa，4 h)，壤理化性質(zhì)為pH值7.05，全氮1.13 g/kg，堿解氮85.88 mg/kg，有效磷17.52 mg/kg，速效鉀 109.24 mg/kg，電導(dǎo)率202.63 μS/cm。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置基質(zhì)水分含量為主處理，施用AM真菌為次處理。次處理為：CK：不施用任何菌劑；FM：接種叢枝菌根真菌(Funneliformismosseae)；TV：接種綠色木霉真菌(Trichodermaviride)；FM+TV：施用Funneliformismosseae和Trichodermaviride；以上處理皆基于培養(yǎng)基質(zhì)75%正常土壤含水率(WW)、土壤55%含水率的干旱處理(DS)，共8個(gè)處理組合。FM處理施用量為40 g/kg，TV處理為施用50 mL菌劑，重復(fù)4次。

盆栽裝置為圓形塑料桶，盆高28 cm，直徑 25 cm。每盆裝土8 kg，將AM真菌菌劑和土壤充分混合，綠色木霉采用灌根方式施入。按照上述處理設(shè)置土壤含水率，將6～7葉齡的蘋果樹幼苗轉(zhuǎn)移至相應(yīng)處理的土壤基質(zhì)中。同時(shí)采用配備林木型ML3x探頭的HH-2 WET/WET -2-K1 Delta-T WET便攜式土壤水分儀監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基質(zhì)含水率，采用滴灌方式補(bǔ)充水分以確保基質(zhì)水分在試驗(yàn)設(shè)定的范圍內(nèi)。試驗(yàn)培養(yǎng)67 d。

1.3 樣品采集及測(cè)定分析

1.3.1 生長(zhǎng)參數(shù)及水分利用參數(shù)抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)測(cè)定 培養(yǎng)結(jié)束后，干物質(zhì)測(cè)定將植株地上部、根系分離105 ℃殺青30 min，65 ℃烘干稱量記錄。株高、莖粗采用數(shù)字尺測(cè)定。采用Epson V850 photo對(duì)根系進(jìn)行掃描，WINR HIZO-PRO2018軟件(Regent Instruments LA2100，Canada)分析根系體積、根系表面積、根系平均直徑參數(shù)。測(cè)定第8～10片完全展開葉的水分利用指標(biāo)，植株水分利用效率(WUE)=DW/用水量；植株相對(duì)含水量(RWC)采用烘干稱質(zhì)量法測(cè)定，RWC=(FW-DW)/(TW-DW)×100%，上述FW、DW、TW分別為鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、膨壓質(zhì)量[13]。

1.3.3 光合色素及光合特征參數(shù)測(cè)定 測(cè)定第 8～10片完全展開葉的光合色素含量，光合色素包含葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素，三者含量皆采用丙酮-乙醇混合浸提，之后采用紫外分光光度計(jì)(UV-2450，Shimadzu，Japan)分別在665、649、470 nm 處測(cè)定，具體方法參照文獻(xiàn)[14]。

采用LI- 6400便攜式光合測(cè)定系統(tǒng)(LI-6400；LI-COR，America)測(cè)定第8～10片完全展開葉的凈光合速率(Pn)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)和氣孔導(dǎo)度(Gs)等指標(biāo)。葉室溫度設(shè)置為(25±1) ℃，CO2濃度為480 μmol/mol，光量子密度為1 200 μmol/(m2·s)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 23.0軟件比較進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析(α=0.05)，采用Origin 2018進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 AM真菌與綠色木霉對(duì)干旱脅迫下蘋果樹苗生長(zhǎng)參數(shù)的影響

由表1可知，正常水分處理(WW)條件下各處理的干物質(zhì)含量(地上部干物質(zhì)、根系干物質(zhì))、地上部生長(zhǎng)參數(shù)(株高、莖粗)及根系性狀參數(shù)(根系表面積、根系直徑、根系體積)皆整體高于干旱處理(DS)，表明干旱脅迫對(duì)蘋果樹幼苗生長(zhǎng)具有不利影響。無論在WW還是DS中，干物質(zhì)含量、地上部生長(zhǎng)參數(shù)及根系性狀參數(shù)皆表現(xiàn)為CK

表1 AM真菌與綠色木霉對(duì)干旱脅迫下蘋果樹苗生長(zhǎng)參數(shù)的影響

2.2 AM真菌與綠色木霉對(duì)干旱脅迫下蘋果樹苗光合色素的影響

由圖1-a可知，在葉綠素a指標(biāo)中，WW處理以FM、TV、FM+TV處理顯著大于CK處理，DS處理中CK、FM、TV處理較FM+TV處理分別顯著降低40.22%、32.07%、22.83%；與WW-CK處理相比，DS條件下的各處理均與其存在顯著差異，且除FM+TV顯著較高外，其余處理皆以WW-CK顯著大于DS的其他處理。由圖1-b可知，在葉綠素b指標(biāo)中，整體以WW大于DS，且無論在WW還是DS條件下，各處理皆呈CK

2.3 AM真菌與綠色木霉對(duì)干旱脅迫下蘋果樹苗光合參數(shù)的影響

由圖2可知，處于干旱條件(DS)下各處理的葉片凈光合速率(Pn)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)及氣孔導(dǎo)度(Gs)皆低于正常水分處理(WW)。無論是在WW還是DS條件下，與其對(duì)應(yīng)的CK處理相比，叢枝菌根真菌處理(FM)和綠色木霉處理(TV)皆整體提高了上述光合氣體交換參數(shù)，尤其表現(xiàn)在DS條件下。光合參數(shù)指標(biāo)中，無論是WW還是DS條件下的各處理均表現(xiàn)為CK

2.4 AM真菌與綠色木霉對(duì)干旱脅迫下蘋果樹苗氧化酶系統(tǒng)的影響

2.5 AM真菌與綠色木霉對(duì)干旱脅迫下蘋果樹苗水分利用的影響

由圖4可知，在水分利用效率(WUE)和葉片相對(duì)含水量(RWC)指標(biāo)中，整體以WW大于DS。無論WW還是DS條件下，與其相應(yīng)水分條件的CK處理相比，叢枝菌根真菌、綠色木霉皆整體提高了上述水分利用參數(shù)，且叢枝菌根真菌和綠色木霉組合施用處理(FM+TV)下各水分利用參數(shù)皆具有較優(yōu)值。在WW條件下，WUE、RWC均呈CK

3 結(jié)論與討論

干旱已成為全球性問題，水資源短缺會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、生理代謝產(chǎn)生不利影響[15]。本研究表明，與正常土壤含水率處理(WW)相比，干旱脅迫處理(DS)整體降低了干物質(zhì)含量(地上部干物質(zhì)、根系干物質(zhì))、地上部生長(zhǎng)參數(shù)(株高、莖粗)及根系性狀參數(shù)(根系表面積、根系直徑、根系體積)。AM真菌及木霉屬菌是土壤中2種重要的功能真菌，然而關(guān)于兩者在脅迫環(huán)境下的生理影響知之甚少[12，16]。本研究中，無論是在WW還是DS條件下，叢枝菌根真菌處理(FM)、綠色木霉處理(TV)皆不同程度地提高了蘋果樹苗的生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)，與WW-CK處理相比，DS條件下的FM、TV處理長(zhǎng)勢(shì)較差，而DS-FM+TV處理略優(yōu)于WW-CK處理，表明干旱環(huán)境下組合接種叢枝菌根真菌、綠色木霉是改善植物生長(zhǎng)發(fā)育的潛在理想技術(shù)。且從試驗(yàn)數(shù)據(jù)看，F(xiàn)M處理略優(yōu)于TV處理，這可能是因?yàn)閮烧吖δ苄问讲煌慕Y(jié)果，叢枝菌根真菌具有廣泛的根外菌絲網(wǎng)絡(luò)，能使宿主植物獲得更多的土壤養(yǎng)分和水分[17]，因此在干旱脅迫下長(zhǎng)勢(shì)較佳。

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，參與光能的吸收、轉(zhuǎn)移、分配和轉(zhuǎn)化過程；類胡蘿卜素是重要的抗氧化物質(zhì)，它可消散PSⅡ天線中多余激發(fā)能量，尤其是在脅迫環(huán)境中[18]。在干旱環(huán)境中，PSⅡ光化學(xué)效率降低的原因可能與葉片光合色素含量減少有關(guān)[19]。本研究中，干旱脅迫顯著降低了蘋果樹苗的光合色素，在此基礎(chǔ)上接種叢枝菌根真菌、綠色木霉均有效提高了葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量(圖2)，這有助于改善光合色素含量從而保證植株葉片的光合進(jìn)程。光合作用是植物生長(zhǎng)發(fā)育所需底物和能量的主要來源，不利的環(huán)境條件會(huì)影響光合性能[20]。本研究表明，干旱脅迫整體降低了蘋果樹苗葉片的凈光合速率(Pn)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)及氣孔導(dǎo)度(Gs)，且無論是在WW還是DS環(huán)境下，F(xiàn)M、TV處理的光合特征參數(shù)均大于CK處理，但2種處理的作用效果存在一定差異，以TV處理效果較佳，這可能是因?yàn)榫G色木霉可以介導(dǎo)光合型α-乙酰輔酶合成及提高其酶活性的緣故[21]。此外，本研究進(jìn)一步表明，DS條件下FM+TV處理Pn、Ci、Tr及Gs皆具有最大值；干旱脅迫下具備較大的氣體交換值則意味著蒸騰作用強(qiáng)烈，可增強(qiáng)誘導(dǎo)根系的水分向地上部運(yùn)輸，從而防止地上部失水及維持光合作用進(jìn)行[4，22-23]。

葉片水分利用可反映環(huán)境水分不足時(shí)植物組織在蒸騰作用過程中的耗水程度和恢復(fù)能力的差異[12，28]。本研究結(jié)果表明，與WW相比，DS環(huán)境下的水分利用效率(WUE)及葉片相對(duì)含水量(RWC)均較低，且無論WW還是DS條件下，F(xiàn)M、TV處理皆提高了WUE和RWC，但皆以FM處理優(yōu)于TV處理。前人研究表明，叢枝菌根真菌自由基菌絲是親水性蛋白菌絲，可有效吸附水分，或通過保護(hù)自由基菌絲免受外部環(huán)境干燥的影響[4，29]，這可能是叢枝菌根真菌處理水分利用優(yōu)于綠色木霉真菌處理的原因。此外，本研究表明，無論WW還是DS條件下，F(xiàn)M+TV處理均具有較大值，且與WW-CK處理相比，WUE、RWC指標(biāo)中DS-FM+TV處理分別顯著提高26.92%、13.64%。綜上，在干旱條件下接種叢枝菌根真菌、綠色木霉皆可提高蘋果樹苗的生長(zhǎng)發(fā)育、促進(jìn)光合作用、激活抗氧化系統(tǒng)及提高水分利用效率，在生長(zhǎng)發(fā)育方面及水分利用方面以單接種叢枝菌根真菌較優(yōu)，內(nèi)在生理方面(光合特征及抗氧化特征)則以綠色木霉表現(xiàn)較好，整體而言，以二者組合施用效果最佳。