煤矸石復墾區玉米根際與非根際土壤細菌群落對覆土厚度的響應

張變華，靳東升，張 強，郜春花，李建華

(1.忻州師范學院，山西忻州 034000； 2.山西農業大學，山西太原 030031)

煤炭開采過程中排放的煤矸石約占原煤產量的15%～20%[1]。據不完全統計，目前我國煤矸石累積排放量已達38億t，并以每年2億t的增長量逐年增加[2]。堆積的煤矸石不僅占用了大量土地，而且對水體、土壤和大氣也造成嚴重污染。采煤礦區通常采用煤矸石回填覆土的方式進行復墾[3-4]。Lubos等通過比較露天煤礦廢棄地表層覆土與未覆土后的土壤特性變化，發現在采煤廢棄地表層覆土后礦區土壤有機碳、腐殖質和有效磷含量顯著增加，促進了復墾土壤的發育[5]。洪堅平等通過研究不同復墾措施對山西陽泉煤矸石山土壤培肥的影響，發現矸石上覆土并種植豆科牧草可顯著改善土壤有機質，快速培肥土壤[6]。郭友紅等的研究表明，覆土厚度會影響農作物的長勢、外觀和產量[7]。劉會平等的研究表明，煤矸石填埋覆土厚度差異會影響土壤生產力[8]。劉鑫堯等的研究表明，煤礦復墾地覆土厚度與小麥產量呈正相關[9]。黃凱的研究表明，覆土厚度會影響充填土壤表層含水量[10]。張軒等的研究表明，60 cm覆土厚度相較于40 cm有利于提高復墾土壤的保水保肥能力，可以增加大豆地下與地上生物量[11]。張軒研究發現，80 cm 和120 cm覆土厚度相較于40 cm的復墾土壤，容重、沙粒含量明顯降低，氣相比例增加，雖然覆土厚度對復墾土壤微生物數量、酶活性及土壤呼吸的影響沒有明顯規律，但80 cm和120 cm覆土厚度利于改善復墾土壤微生物群落功能多樣性[12]。陳孝楊等的研究表明，煤矸石充填復墾時，覆土較薄(20～40 cm)會降低土壤呼吸速率，對溫度敏感性較強，不利于生物活動；覆土較厚(>100 cm)會使有利于生物活動的積極因素消失[13]，且會浪費資源從而加大復墾成本[12]。因此，適宜的覆土厚度是礦區復墾成功的關鍵[14]。

土壤微生物多樣性是表征土壤肥力水平高低的敏感性指標。然而，綜上所述，當前利用現代高通量測序技術對不同覆土厚度下復墾土壤細菌群落結構及其多樣性的研究鮮見報道。由于根際是土壤微生物與植物相互作用的重要場所[5]。所以本研究選擇山西屯蘭礦區復墾地為研究對象，分析不同覆土厚度下玉米根際與非根際土壤細菌群落組成及其多樣性，以期為礦區生態恢復和重建技術提供一定參考依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗區位于山西省古交屯蘭煤矸石復墾區，年平均氣溫約9.5 ℃，年平均降水量約460 mm。本試驗設置3個覆土厚度，分別為40、80、120 cm。不同覆土厚度下的試驗小區面積均為20 m2(4 m×5 m)。于2020年5月28日采用人工點播的方式種植玉米，施肥方式為人工撒施肥料，施肥種類為有機肥配施無機肥，施肥量為有機肥7 500 kg/hm2、無機肥600 kg/hm2，株距、行距分別為30、55 cm。

1.2 樣品采集

于2020年7月9日(玉米花期)，在不同覆土厚度下(40、80、120 cm)的試驗小區，進行根際與非根際土壤樣品采集。

根際土壤：在各試驗小區選擇長勢差不多的玉米3株，利用挖掘法和抖落法[15]進行采集，先抖落掉玉米根系大塊土，然后將用毛刷輕輕刷下的0～2 mm 的根際土收集在無菌塑料袋中，密封后放入裝有冰袋的保溫箱內，帶回實驗室進行室內分析化驗。

非根際土壤：利用土鉆按照對角線法采集不同覆土厚度下玉米株間深度為0～20 cm的土壤樣品，放入滅菌袋，密封后放入(4 ℃保溫箱)帶回室內進行化驗。

根際與非根際土壤樣品，每個處理3次重復。未能及時做微生物培養試驗的土樣放在-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.3 試驗方法與數據處理

高通量測序由上海派森諾生物科技有限公司對玉米根際與非根際土壤進行微生物組DNA提取、目標片段聚合酶鏈式反應(PCR)擴增、產物回收純化、熒光定量等，使用MiSeq型測序儀測定玉米根際與非根際土壤中細菌 V3-V4擴增于序列變體區(amplicon sequence variants，ASV)序列單元。

土壤全氮含量采用半微量開氏法測定，有機質含量采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定；有效磷含量采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定；速效鉀含量采用乙酸銨浸提-火焰光度法測定；堿解氮含量利用堿解擴散法進行測定；pH值采用水土比為2.5 mL ∶1 g的方法測定。

利用Origin、Qiime與Canoco軟件對土壤中細菌數據進行整理和統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同覆土厚度下復墾土壤細菌ASV分析

ASV指擴增子測序中按照100%相似水平下聚類形成的序列單元。由圖1可知，不同覆土厚度下玉米根際與非根際土壤中細菌ASV數量范圍為 1 133～3 862個。覆土厚度為80cm處理的復墾地玉米根際土壤中ASV數量最多。對于玉米根際土壤，細菌ASV數量從大到小為R80>R40>R120；對于非根際土壤，順序則為S80>S120>S40。

2.2 不同覆土厚度下復墾土壤細菌門和屬特征

從圖2可以看出，不同覆土厚度下玉米根際與非根際細菌中相對豐度較高的前十種細菌門包括放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)、厚壁菌門(Firmicutes)、Patescibacteria門、藍藻門(Cyanobacteria)。放線菌門和變形菌門的相對豐度均大于10%，相對豐度范圍分別為34.71%～63.61%和18.56%～32.03%，為該復墾區不同覆土厚度下的優勢細菌門。同一覆土厚度下，玉米根際土壤放線菌門的相對豐度均高于非根際土壤，變形菌門的相對豐度均低于非根際土壤，80 cm厚度處理相較于40 cm和120 cm處理玉米根際放線菌門的相對豐度有所增加，根際變形菌門的相對豐度有所降低。而40 cm厚度處理相較于80 cm和 120 cm 處理非根際土壤中放線菌門的相對豐度有所降低；80 cm 厚度處理相較于40 cm和120 cm厚度處理非根際土壤中變形菌門的相對豐度有所增加。

從圖3可以看出，不同覆土厚度下根際與非根際土壤中相對豐度較高的前20種細菌屬中，相對豐度均大于1%的細菌屬有溶桿菌屬(Lysobacter)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、類諾卡式屬(Nocardioides)和67-14屬；還發現同一覆土厚度下非根際土壤中溶桿菌屬、分枝桿菌的相對豐度均高于根際土壤，類諾卡式屬的相對豐度則表現為非根際土壤低于根際土壤。在根際土壤中，相較于40、120 cm厚度處理，80 cm厚度處理溶桿菌屬、分枝桿菌的相對豐度有所降低，類諾卡式屬的相對豐度有所提高；在非根際土壤中，80 cm厚度處理相較于40 cm和120 cm厚度處理67-14屬的相對豐度有所增加。

總體來看，覆土厚度可以改變根際與非根際土壤中細菌門和屬的相對豐度，根際與非根際土壤中的細菌群落有差異。

2.3 不同覆土厚度下復墾土壤中的細菌α多樣性

微生物α多樣性通常用Chao1、Shannon、Pielou和Simpson指數表征，它們分別表示微生物豐富度、物種多樣性、均一度和優勢度。

從圖4可以看出，對于根際土壤而言，80 cm厚度下玉米根際土壤Chao1指數顯著高于120 cm厚度處理，但與40 cm厚度處理差異不顯著；80 cm厚度處理Shannon、Pielou和Simpson指數均最低，但與40 cm和120 cm厚度處理差異不顯著。 對于非根際土壤而言，80 cm厚度下Chao1、Shannon、Pielou均顯著高于40 cm厚度處理，但與120 cm厚度處理差異不顯著。各覆土厚度處理間Simpson指數無顯著差異。

從圖4也可以看出，同一覆土厚度下，根際與非根際土壤間Simpson指數無顯著差異。80 cm厚度下，非根際土壤Shannon和Pielou指數顯著高于玉米根際土壤，40 cm和120 cm厚度下根際與非根際土壤間差異不顯著。對于Chao1指數，80 cm和 120 cm 厚度下均表現為根際土壤低于非根際土壤，但120 cm厚度下差異顯著；40 cm厚度下則表現為根際土壤顯著高于非根際土壤。

總體來看，覆土厚度可以改變復墾土壤細菌多樣性，80、120 cm的覆土厚度相較于40 cm有利于提高復墾區非根際土壤細菌多樣性。

2.4 不同覆土厚度下復墾土壤細菌群落結構的β多樣性

利用Origion軟件對不同覆土厚度下玉米根際與非根際土壤細菌群落結構進行主坐標分析(Principal coordinates analysis，簡稱PCoA)。由圖5可以看出，PCo1和PCo2分別解釋24.7%和13.4%。PCoA1將玉米根際與非根際土壤細菌群落隔開，非根際土壤分布在第一、第四象限，根際土壤基本分布于第二、 第三象限。PCoA2將40 cm厚度與80、120 cm厚度分隔開，對于非根際土壤，80 cm和120 cm厚度分布于第一象限，40 cm分布于第四象限，說明80 cm與120 cm厚度下土壤細菌群落差異不大，但它們與40 cm厚度間差異較大。對于根際土壤而言，80 cm覆土厚度位于第三象限，但與 40 cm 和120 cm厚度的間距較近，所以不同覆土厚度間根際細菌群落差異不大。

2.5 玉米根際與非根際土壤細菌群落結構與土壤環境因子相關性的冗余分析(RDA)

利用Canoco軟件對不同覆土厚度下玉米根際與非根際土壤中前20種細菌屬與土壤中全氮含量、有機質(OM)含量、速效鉀(AK)含量、有效磷(AP)含量、堿解氮含量和pH值進行了RDA分析。結果表明，不同覆土厚度下玉米根際與非根際土壤中細菌群落結構與根際與非根際土壤中速效鉀含量、有機質含量顯著相關，其中速效鉀含量的貢獻率最大，達58.2%，其次為有機質和有效磷，貢獻率分別為13.4%和5.7%(表1)。同時，從圖6也可以看出，不同覆土厚度下根際與非根際差異較大。對于非根際土壤而言，40 cm厚度處理與80、120 cm厚度處理間差異較大；而不同覆土厚度下根際土壤間差異不大。

表1 RDA前選擇結果

3 討論

3.1 覆土厚度影響玉米根際與非根際土壤細菌微生物群落結構

本研究結果表明，該復墾區各覆土厚度下玉米根際與非根際土壤中放線菌門和變形菌門的相對豐度最高，是該煤矸石填埋復墾區優勢細菌門。該結果與李金融等報道的結果[16]類似。因為放線菌門、變形菌門均為適應環境能力強的細菌。變形菌門多為異養或者兼性營養細菌；放線菌門能降解大量不同種類的有機化合物，對有機物的礦化有著重要功能[16]，能在礦區惡劣環境中生存[17]。

許多研究表明，植物根際和非根際土壤中微生物群落有差異[18-21]。本研究表明，同一覆土厚度下，玉米根際土壤放線菌門、類諾卡式屬的相對豐度均高于非根際土壤；玉米非根際變形菌門、溶桿菌屬、分枝桿菌屬的相對豐度均高于根際土壤。這是因為植物20%～50%的光合同化產物轉移到地下部，大部分以有機和無機分泌物形式釋放到根區[22]，能夠促進或抑制某些特定類群的增殖和豐度的提高。本研究也發現，覆土厚度會改變根際與非根際細菌群落結構，如80 cm厚度相較于40、120 cm玉米根際放線菌門、類諾卡式屬的相對豐度有所增加，根際變形菌門、溶桿菌屬、分枝桿菌的相對豐度有所降低。原因是覆土厚度會影響復墾區作物根系的生長[8]。本研究表明，80 cm的覆土厚度或可促進玉米根系分泌有利于根際放線菌門、類諾卡式屬生長的物質，為其提供充足的基質與能量，進而增加其相對豐度。

3.2 覆土厚度影響作物根際與非根際土壤細菌微生物多樣性

覆土可以改變礦區土壤水分、結構及作物根系生長，適宜的覆土厚度在礦區植被恢復和生態重建中有重要的作用。眾多研究表明，較高的微生物多樣性對于增強生態系統和微生物功能的穩定性較好[23-24]，且作物根系活動會導致作物根際與非根際土壤間的微生物多樣性產生明顯差異[25-26]。Berg等研究發現，根際細菌群落的多樣性普遍低于非根際土壤[27]。本研究也發現，80 cm厚度下非根際土壤細菌群落Shannon和Pielo-Eveness指數顯著高于玉米根際土壤；80 cm覆土厚度下玉米根際土壤細菌豐富度指數(Chao1)均高于40 cm和120 cm厚度處理，且80 cm厚度下非根際土壤中物種多樣性指數、均一度指數均顯著高于40 cm厚度處理，但與120 cm厚度間無顯著差異。β多樣性分析表明，非根際土壤細菌群落結構在80 cm厚度處理與40、120 cm厚度處理差異顯著。加之由于80 cm相較于120 cm的覆土厚度利于節約成本，所以覆土 80 cm 應是該煤矸石填埋復墾區較為適宜的覆土厚度，不僅可以增加復墾土壤細菌多樣性，為玉米生長提供良好的土壤環境，而且對于維持煤矸石填埋復墾區生態系統功能有良好的作用。

3.3 各覆土厚度下作物根際與非根際土壤細菌群落與土壤養分關系

Wang等研究發現，土壤養分在根際與非根際微生物群落多樣性中作用有差異，認為土壤養分中全氮含量、有效磷含量、速效鉀含量和有機質含量與根際細菌群落多樣性顯著相關[28]。本研究表明，各覆土厚度下玉米根際與非根際土壤中細菌群落結構與土壤中速效鉀含量、有機質含量顯著相關。這是因為礦區復墾土壤由于本身具有有機質含量低、養分貧瘠的特征，土壤中細菌群落特征會因土壤性質不同而有差異[29]。

4 結論

本研究表明，放線菌門和變形菌門為該復墾區各覆土厚度下的玉米根際與非根際土壤中的優勢細菌門，溶桿菌屬、分枝桿菌屬、類諾卡式屬和67-14屬為優勢細菌屬。覆土厚度可以改變玉米根際與非根際土壤中的細菌群落結構及其多樣性。無論玉米根際還是非根際土壤，80 cm覆土厚度下土壤中ASV數量最多，且玉米根際細菌ASV數量均高于非根際。該覆土厚度不僅能夠提高玉米根際放線菌門、類諾卡式屬的相對豐度，增加非根際土壤中變形菌門、67-14屬的相對豐度；而且可以增加復墾土壤中的細菌群落物種多樣性和均一度指數，土壤中的速效鉀、有效磷和有機質驅動其變化的主要養分因子。結合經濟投入，認為覆土80 cm為該復墾區較為適宜的覆土厚度。