不同生長期栽培型馬齒莧功能成分及抗氧化活性研究

趙學志，丁云花，張俊倩，唐小燕，宋曙輝

（1. 北京市農林科學院農產品加工與食品營養研究所，北京 100097；2. 果蔬農產品保鮮與加工北京市重點實驗室，北京 100097；3. 北京市農林科學院 蔬菜研究所，北京 100097）

馬齒莧為一年生草本植物，世界各地均有分布。其抗病性強，對土壤和環境要求不高，易于生長，產量高。馬齒莧為藥食兩用植物資源。在歐洲地中海沿岸，作為日常食用蔬菜，同時具有利尿、退熱、殺菌、抗痙攣、殺蟲作用及抗膽堿酯酶活性[1-2]。我國將馬齒莧作為傳統中藥也有很長的歷史。在“本草綱目”中記載馬齒莧具有抗炎消腫等功效。現代藥理學研究表明，馬齒莧還具有降血糖、調節血脂、抗炎、抗氧化等功能[3-6]。馬齒莧營養豐富，富含ω-3 脂肪酸，特別是α -亞麻酸含量，是植物資源中含量較高之一[7]，其ω-6/ω-3 小于2，有利于人體對脂肪酸的平衡和利用，起到預防心血管疾病發生的作用[8]。另外，含有抗壞血酸、類胡蘿卜素、鐵等礦質元素，且含有黃酮、酚酸、多糖、生物堿、馬齒莧酰胺等功能性成分[9-11]。近幾年，栽培型馬齒莧作為一種新型蔬菜逐漸走進餐桌。栽培型馬齒莧株型大、直立、產量高[12]，同樣富含多種營養功能性成分[13]。以往的研究多以野生型馬齒莧為主[14]。針對栽培型馬齒莧的功能成分及抗氧化功能進行試驗，為栽培型馬齒莧的開發積累理論和試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

栽培型馬齒莧，蔬菜中心實驗農場種植。分別在苗期G1、G2、營養生長期G3、現蕾期G4 和成熟期G5、G6 取樣。

1.2 試劑

辣根過氧化物酶（HRP）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-pierylhydrazy；DPPH）、肌紅蛋白（Myoglobin）、ABTS （2,2'-Azinobis（3-ethyl benzothiazoline 6-sulphonate）、黃嘌呤（Xanthine）、黃嘌呤氧化酶（XOD），Sigma 公司提供；萘乙二胺（NED）、對氨基苯磺酸、過氧化氫、L -酪氨酸、氫氧化鈉、雙氧水、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醇，均為國產分析純。

1.3 儀器

KQ-600DE 型超聲波振蕩儀，昆山市超聲儀器有限公司產品；20A 型高效液相色譜儀，日本島津產品；HITACHI U-3410 型紫外分光光度計；LD5-2B 型離心機，北京京立離心機有限公司。

1.4 樣品制備

取新鮮馬齒莧，去掉老葉、黃葉，清洗后切分，真空冷凍干燥后粉碎并過60 目篩。按相應的方法稱取冷凍干燥馬齒莧粉進行分析。抗氧化試驗，稱取馬齒莧冷凍干燥粉5.0 g，按1∶20 加入70%乙醇作為提取劑，超聲波提取30 min，以轉速3 500 r/min離心20 min 后取上清液，樣品質量濃度以每毫升溶液中干物質含量表示。

1.5 試驗方法

1.5.1 功能成分檢測

葉綠素測定參照NY/T 3082—2017；類胡蘿卜素測定參照文獻[15]；總黃酮測定采用硝酸鋁比色；總酚測定采用Folin 酚比色法[16]；多糖測定參照功能食品中多糖的檢測方法[17]。

1.5.2 抗氧化活性[18]

（1） DPPH·試驗。稱取DPPH，用無水乙醇配成濃度為2×10-4mol/L 的溶液，冷藏于冰箱中。

DPPH·試驗加樣表見表1。

表1 DPPH·試驗加樣表

用力搖勻，將Ai所表示的樣品在室溫下靜置30 min 后，加入1 cm 比色皿中進行吸光度的測定，測出A0、Ai、Aj的吸光度，按下列公式進行清除率的計算。

（2） ABTS-肌紅蛋白- H2O2系統。將磷酸鹽緩沖液、馬齒莧提取液、ABTS、 肌紅蛋白按順序加入1 mL 比色皿中，每個濃度做5 個平行樣，再帶1 份試劑空白，然后于分光光度計前，在5 個平行樣中分別加入過氧化氫，空白中不加過氧化氫，迅速混勻后，放入樣品池中，置于30 ℃恒溫條件下，于波長734 nm 處測定吸光度。

（3） Xan-XOD 試驗系統。在總體積1 mL 的溶液中含有：100 mmol/L 磷酸緩沖液pH 值7.4，1 mmol/L鹽酸羥胺（HONH2.HCl），500 mol/L 黃嘌呤，0.04 U/mL黃嘌呤氧化酶。將磷酸緩沖液、羥基氯化銨、黃嘌呤，不同濃度的馬齒莧提取液以及XOD 依次加到1 mL 具塞塑料離心管內，蓋緊蓋后，放到37 ℃水浴振蕩，培養30 min。水浴期間，準備好相應的微量比色皿，并分別加入質量分數為1%的對氨基苯磺酸溶液0.3 mL，水浴結束后，迅速加入反應液0.3 mL和0.02%的NED 0.3 mL。在紫外-可見分光光度計上，于波長540 nm 處分別測定吸收度。

（4） 酪氨酸-二酪氨酸（Tyr/di-Tyr） 系統。在玻璃試管內依次加入磷酸鹽緩沖液、酪氨酸，不同濃度馬齒莧提取液，過氧化氫和HRP，37 ℃水浴振蕩60 min 后，取出，立即用1mol/L HCl 溶液終止反應，于HPLC 測定酪氨酸和二酪氨酸含量。

反應原理見圖1。

圖1 反應原理

HPLC 條件：1 色譜柱：Diamond 250 mm×4.6 mm；2 流動相：A 液：50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液pH 值2.4；B 液：甲醇100%；梯度洗脫程序：B 液濃度由1 min 時的0 線性漸變到6 min 的30%，再漸變到10 min 的0，保持8 min；檢測波長285 nm；流速1.0 mL/min；進樣量20 μL。

1.6 數據統計

每組試驗進行3 次重復，結果以X±SD 表示。采用SPSS 19.0 進行相關性分析、方差分析。

2 結果與分析

2.1 馬齒莧不同采收期功能成分的變化

不同生長期馬齒莧功能成分含量見表2，馬齒莧不同生長期功能成分的變化見圖2。

表2 不同生長期馬齒莧功能成分含量 / mg·g-1 DW

圖2 馬齒莧不同生長期功能成分的變化

植物中的功能成分主要為次生代謝產物，其合成的多少受基因型及外界環境影響較大。幼嫩組織生長旺盛，多酚合成代謝大于分解代謝，且旺盛生長的器官中生長素的含量較高，貯存器官中酚類化合物調運迅速[19]。多數研究表明植物幼嫩組織中多數酚類物質的含量顯著高于成熟組織[20-21]。由圖2 可知，馬齒莧的多酚和黃酮含量都表現為苗期至營養生長期最高。

由表2 和圖2 可以看出，除多糖外，其他幾種功能成分均表現為苗期和營養生長期含量高，之后逐漸下降。不同功能成分在生長不同時期呈現出較大差異。總黃酮含量最大相差5.2 倍，多酚相差3.3倍，類胡蘿卜素相差4.6 倍，葉綠素相差4.5 倍，多糖相差2.0 倍。

2.2 馬齒莧不同生長期抗氧化活性變化

馬齒莧不同生長期4 種抗氧化方法的IC50值見表3。

表3 馬齒莧不同生長期4 種抗氧化方法的IC50 值 / mg·mL-1

試驗中所采用的4 種抗氧化方法，分別從不同的機理來表明抗氧化能力。DPPH 自由基清除評價方法是目前最常用的抗氧化方法，簡便且易于大量篩選抗氧化活性，可作為初步篩選的方法。ABTS 方法與DPPH 自由基清除方法相似，但靈敏度更高。另外2 種抗氧化方法，模擬了體內自由基產生途徑和清除機理，酪氨酸方法模擬體內大分子蛋白質受損的過程，Xan-XOD 方法模擬缺血再灌注后產生的自由基，有一定的生物學意義。4 種抗氧化方法都顯示了馬齒莧在營養生長期抗氧化活性較高。苗期的抗氧化活性最高，尤以播種后22 d，此時苗齡20 d，4 片真葉，為馬齒莧苗生長旺盛期。結果顯示，馬齒莧在不同生長時期的抗氧化性能有很大差異。Xan-XOD 法相差10 倍，DPPH 相差5.5 倍，ABTS 法相差4.2 倍，酪氨酸/二酪氨酸法相差3.5 倍。

2.3 馬齒莧功能成分含量與抗氧化活性的相關性

馬齒莧功能成分含量與抗氧化能力的相關性（R） 分析見表4。

表4 馬齒莧功能成分含量與抗氧化能力的相關性（R） 分析

由表4 可以看出，馬齒莧中幾種功能成分都與抗氧化活性呈正相關，即與IC50值呈負相關，但未達到顯著性差異（p＞0.05）。植物中的多酚類化合物是公認的具有很強抗氧化活性的次生代謝產物，可清除體內過剩的自由基，防止DNA、蛋白質和脂質等生物大分子氧化損失，從而預防癌癥、糖尿病等疾病的發生[22-23]。多羥基酚酸能夠清除幾乎所有類似自由基的氧化劑分子。試驗中可以看出，多酚和黃酮對抗氧化活性貢獻較為明顯，其含量與抗氧化性呈正相關。葉綠素的貢獻最小。類胡蘿卜素居中。多酚含量與黃酮，多酚與類胡蘿卜素，類胡蘿卜素與葉綠素含量呈極顯著正相關（p＜0.01），黃酮與類胡蘿卜素、黃酮與葉綠素、多酚與葉綠素呈顯著正相關（p＜0.05）。4 種抗氧化方法之間，Xan-XOD 法和DPPH 和ABTS 呈 極 顯 著 正 相 關（p＜0.01），Xan-XOD 法和酪氨酸法呈顯著正相關（p＜0.05）。酪氨酸法和DPPH 和ABTS 呈極顯著正相關（p＜0.01），DPPH 和ABTS 法呈顯著正相關（p＜0.05）。

3 結論

針對栽培型馬齒莧的幾種功能成分進行分析，并采用4 種抗氧化方法進行抗氧化活性評價。結果表明，馬齒莧各功能成分及抗氧化活性在不同生長期呈現動態變化。

試驗結果中，功能性成分與抗氧化活性呈現一定的正相關性。除多糖外的幾種功能成分都表現為苗期含量高，抗氧化試驗結果也同時顯示出抗氧化活性在苗期最高。在相關性分析中可以看出，4 種抗氧化方法之間為顯著及極顯著正相關。

試驗中多糖的含量與抗氧化性能為負相關（結果未列出），多糖提取的步驟之一為醇沉，試驗采用的是70%乙醇為提取劑，此種情況下，多糖沉淀無法提取出來，因而結果不能真正表明多糖的抗氧化性能。這也從反面證實了抗氧化性能與功能成分之間的相關性。其他幾種功能成分在醇相條件下可以提出，因而可以反映與抗氧化性能的關系。

試驗結果表明，馬齒莧營養生長期相較于苗期產量高，功能性成分相對較高，抗氧化性能好，在兼顧功能成分及商品性時，馬齒莧的最佳采摘期為營養生長期，這也是馬齒莧的最佳食用時期，適口性最好。待進入現蕾生長期，盡管可以食用，但口感外觀等商品性能下降。栽培過程中可以采取適當措施推遲現蕾開花，達到積累功能成分的目的。試驗結果可以為栽培型馬齒莧的開發利用提供一定的參考。