參竹心康方治療慢性心力衰竭的作用機制*

趙夢雪，喻正科，趙啟，李珊珊，陳靜

1 湖南中醫藥大學 湖南長沙 410006

2 湖南省中醫藥研究院附屬醫院 湖南長沙 410006

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是由于各種原因導致的心臟收縮或舒張功能異常，無法滿足身體的代謝需求，由此產生的一系列癥狀和體征的臨床綜合征[1]。據統計，我國心血管疾病現患人數高達3.3億，其中心力衰竭890萬例[2]。流行病學調查顯示，65歲以上人群心衰發病率高，死亡率和再住院率居高不下[3-4]，預計未來20年內，心衰的患病率將增加25%[5]，全球負擔將急劇增加。目前西醫治療心衰主要以強心、利尿、擴血管、拮抗神經內分泌激活及改善心室重構為主，主要針對心臟本身癥狀，不能解決心衰常見的伴發癥狀，大量臨床及實驗證明中醫藥可以通過多方面、多靶點的相互作用對慢性心力衰竭進行調控和改善，由此體現出其顯著優勢和廣闊前景[6]。

參竹心康方是湖南省名中醫喻正科教授的臨床經驗方，由黨參、麥冬、黃芪、五味子、丹參、玉竹、三七、黃精、紅花、澤蘭、姜黃、葶藶子12味中藥組成，主要針對慢性心力衰竭氣陰兩虛，瘀血內阻這一主要病機，既往多項研究均證實參竹心康方對慢性心力衰竭療效顯著，能夠降低心力衰竭患者胰島素抵抗，提高胰島素敏感性；改善血管內皮依賴性舒張功能；減輕心肌纖維化、改善心室重構等[7-13]。在不斷完善的計算機技術的支持下，網絡藥理學蓬勃發展，日益成熟，揭示出藥物成分在疾病轉歸中發揮的作用，其構建的網絡關系與中醫學理論體系中整體觀念這一基本特點相契合[14]。本研究采用網絡藥理學方法，從物質基礎和分子水平探索參竹心康方治療CHF的作用機制，為其臨床應用提供科學依據。

資料與方法

1 參竹心康方活性成分及相關靶點篩選

通過檢索TCMSP數據庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），尋找中藥化學組成成分，以OB≥30%且類藥性DL≥0.18兩個ADME屬性值作為靶點篩選標準。將所獲蛋白質靶點在Uniprot蛋白質數據庫（https：//www.uniprot.org）中完成基因名稱的轉化。檢索 ETCM 數 據 庫（http：//www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/）篩選補充TCMSP中未收錄的中藥—麥冬的化學成分，在化源網（https：//www.chemsrc.com/）中獲取化學成分 CAS號，利用 PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢麥冬化學成分的2D結構及SMILES 結構式，導入SwissADME數據庫（http：// www.swissadme.ch/）后，分析其胃腸道吸收利用度（gatrointestinal absorption，GA）及 DL，篩選條件：GA 值為“High”、DL5項（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、 Muegge）中“Yes”≥ 2 項。將篩選出的活性成分的2D結構導入SwissTargetPrediction 數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/），選擇“homo sapiens”為物種信息，預測作用靶點，篩選條件：probability>0，完成麥冬活性成分作用靶點的篩選。

2 構建參竹心康方“活性成分-靶點”網絡

將參竹心康方活性成分及靶點文件分別導入Cytoscape3.7.1軟件，構建參竹心康方“活性成分-靶點”網絡，利用Network Analyzer功能做進一步分析，獲得具體特征數據及關系網絡。

3 慢性心力衰竭相關靶點篩選

以“chronic heart failure”為檢索關鍵詞，在 Dis-GeNET 數據庫（https：//www.disgenet.org/）、DrugBank數 據 庫（https：//go.drugbank.com/）、OMIM 數 據 庫（https：//omim.org/）、GeneCards 數據庫（https：//www.genecards.org/）中尋找CHF的潛在靶點，根據經驗以“Score”值為GeneCard 數據庫篩選依據，設置Score值大于中位數，合并各疾病數據庫靶點，刪除重復值得到CHF靶點。

4 參竹心康方治療慢性心衰共同靶點的篩選

利用在線韋恩分析工具（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）繪制參竹心康方活性成分與CHF相關靶點韋恩圖并獲取交集靶點。

5 蛋白質相互作用（PPI）網絡構建及核心靶點篩選

將參竹心康方與CHF交集靶點導入STRING（https：//string-db.org/）數據庫，構建 PPI網絡，選擇人類物種，設置置信度>0.4，得到PPI網絡圖，將PPI網絡數據以TSV格式保存，在Cytoscape3.7.1中進行可視化處理，以節點連接度（Degree）為指標，篩選Degree排名前6的靶點為核心靶點[15]。

6 通路富集分析

Metascape 平 臺（http：//metascape.org/gp/index.html）數據全面可靠，是目前最權威的數據平臺之一。將參竹心康方與CHF共同靶點導入Metascape平臺，分別進行信號通路富集（KEGG）分析和基因功能分類（GO），設置P<0.01，應用微生信平臺（http：//www.Bioinformatics.com.cn）將結果進行KEGG 通路富集分析氣泡圖和GO生物功能分析柱狀圖的繪制。

結 果

1 參竹心康方活性成分及相應靶點

利用TCMSP數據庫，根據篩選標準，共得到158個有效成分，其中黃芪17個，玉竹5個，丹參54個，三七7個，黃精9個，紅花15個，澤蘭2個，姜黃3個，葶藶子9個，麥冬12個，五味子8個，黨參17個。

檢索出靶點1688個，其中黃芪213個，玉竹18個，丹參136個，三七184個，黃精85個，紅花205個，澤蘭44個，姜黃32個，葶藶子188個，麥冬457個，五味子19個，黨參107個，去除重復靶點后，共得到618個藥物靶點。

2 參竹心康方“活性成分-靶點”網絡構建和分析

利用 Cytoscape 3.7.1繪制出參竹心康方活性成分及靶點的互作網絡并進行Network Analyzer分析后，共獲得776個節點（包含618個靶點和158個活性成分）與4016條關系（圖1）。根據Degree值，由高到低將參竹心康方的部分活性化合物進行排序（表1）。這些化合物分別為：槲皮素、β- 谷甾醇、山奈酚、木犀草素、豆甾醇、N-反式-阿魏酰酪胺、甲基麥冬黃烷酮B、常春藤皂苷元、黃芩苷、異鼠李素等。

表1 參竹心康方核心活性成分信息

圖1 “活性成分—靶點”網絡圖

3 慢性心衰疾病靶點

檢索 DisGeNET、DrugBank、OMIM、GeneCards數據庫，得到慢性心衰靶點個數分別為224、13、577、1325，篩選匯總以上數據庫靶點，去除重復項，獲得1913個疾病靶點。韋恩圖結果顯示，藥物與疾病交集靶點為206個（圖2）

圖2 藥物靶點和疾病靶點分布圖

4 靶點蛋白的交互作用網絡

由PPI網絡圖（圖3）可知，該網絡由206個節點及4684條相互作用的邊組成。選取節點度值為評價指標，數值越大表明其在此網絡中越重要，在生物學功能中發揮的作用也更加突出；從顏色來看，節點度值由大到小，其節點顏色由藍綠黃橙依次漸變。排名前六的靶點為 AKT1、VEGFA、IL6、TNF、TP53、IL1B，這些就可能是參竹心康方治療CHF的關鍵靶點。

圖3 參竹心康方對慢性心衰作用靶點的蛋白互作網絡圖（Degree>20）

5 GO生物功能和 KEGG 通路富集分析

將參竹心康方與CHF共同靶點導入Metascape平臺，進行 GO 生物功能分析和 KEGG 通路富集分析，獲得 GO 生物功能條目2791 條，其中生物過程有2428條，主要涉及激酶活性的調節、對無機物的反應、細胞對氮化合物的反應、細胞遷移的正向調節、凋亡信號通路的調控等；細胞組分共139 條，主要涉及膜筏、囊泡腔、受體復合物、細胞質核周區、轉錄調節復合物等；分子功能224條，主要涉及蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白質結構域特異性結合、激酶結合、細胞因子受體結合等。KEGG通路富集分析共獲得204 個信號通路，主要涉及癌癥的途徑、AGERAGE信號通路在糖尿病并發癥中的作用、PI3K-Akt信號通路、JAK-STAT信號通路、Th17細胞分化、糖尿病性心肌病、鈣信號通路、cAMP信號通路、腫瘤轉錄失調、cGMP-PKG信號通路等。見圖4-5及表2。

表2 復方作用靶點KEGG分析

圖4 參竹心康方治療慢性心衰活性成分-疾病共同靶點 GO 分析

討 論

心衰病名最早出現在宋·趙估所編《圣濟總錄·心臟門》，根據疾病特點，多將本病歸屬于中醫學“脫證”“心悸”“喘息”“水腫”“痰飲”“心痹”等范疇，總以本虛標實，本虛乃氣虛陽虛，突出心腎；標實為痰、水、瘀，三者同為病因又作為病理產物互相影響[16]。參竹心康方針對慢性心力衰竭常見之氣陰兩虛，瘀血內阻的病機組方，以黨參、麥冬為君，相輔相成，益氣養陰。黃芪、五味子補益心肺，配伍黨參助心肺鼓動血脈；玉竹與麥冬合用，更滋心陰，丹參、三七活血化瘀，黃精補氣養陰，以上六味同為臣藥。紅花、澤蘭佐助臣藥丹參、三七活血通脈，葶藶子瀉肺平喘利水，以上三味共為佐藥。諸藥合用則中氣鼓舞，心肺氣血充沛，氣行則瘀血化，全方共奏氣血同治、補瀉兼施之功[17]。

本研究通過分析“復方-活性成分-靶點”網絡，選取Degree值作為標準預測出參竹心康方治療CHF的主要成分為：槲皮素、β- 谷甾醇、山奈酚、木犀草素、豆甾醇、N-反式-阿魏酰酪胺、甲基麥冬黃烷酮B、常春藤皂苷元、黃芩苷、異鼠李素等。槲皮素作為黃酮類化合物在自然界分布廣泛，研究發現其在多個系統的疾病中都發揮了藥用價值，在心血管方面，作用包括抗心肌纖維化、改善心功能、保護血管內皮、減輕心肌炎性損傷、糾正心室重構以及抗血小板聚集等[18]。山奈酚對心臟成纖維細胞的增殖與活化具有明顯抑制作用，可以調節ASK1/MAPK信號通路的傳導預防心臟肥大，機制涉及對ROS水平、細胞色素C釋放的調節以及對線粒體膜電位的維持等[19-20]。木犀草素具有顯著的心血管疾病相關益處，能夠降低心肌缺血再灌注造成的損傷，并且能夠有效抑制炎癥反應，發揮對心力衰竭的保護作用。阿霉素誘導的大鼠心衰實驗表明[21]，長期的木犀草素治療能夠部分逆轉心室重塑改善心功能，其作用機制與抑制TNF-α誘導的ROS的生成、降低NOX4、p22phoxex的表達、增強心肌肌漿網 Ca2+ -ATP 酶（SERCA2a）的轉錄活性等密切相關[22-23]。黃芩苷可抑制心肌纖維化，抑制MMP2 和 MMP9 的表達和活性，以及心臟組織中的凋亡。在心肌缺氧時，可產生ROS，減輕氧化應激反應，使心肌細胞存活，通過下調Ca（2+）/CaMKII的磷酸化和SERCA2和RYR2的上調等起到減輕心肌重塑并改善心功能的作用[24]。異鼠李素具有多種生物活性，在心血管方面，具有抑制血管平滑肌、心肌細胞增生肥大、抗炎、抗栓等多種作用[25]。

圖5 參竹心康方治療慢性心衰活性成分-疾病共同靶點KEGG分析

本研究所得靶點按照度值排名，較為重要的有 AKT1、VEGFA、IL6、TNF、TP53、IL1B、EGFR、CASP3、JUN、CTNNB1。AKT可以調節心肌生長、心肌血管生成、葡萄糖代謝和心肌細胞死亡。 AKT1作為AKT的亞型，廣泛存在于機體各組織中。研究表明，AKT1通過激活血管內皮細胞一氧化氮合酶（eNOS）促進細胞存活；通過促進Ser9磷酸化使糖原合成酶激酶3β（GSK3β）蛋白失活防止細胞凋亡；通過上調基質金屬蛋白酶（MMPs）的水平實現對內皮細胞增殖與遷移的調控；還能抑制RPS6KB1信號傳導增強細胞自噬等，在多種生物學過程中發揮重要作用[26，27]。VEGFA是血管通透性和血管生成的主要調節劑，還可以激活參與心肌收縮和新陳代謝的基因的表達。研究表明，VEGFA在心臟疾病的病理過程中作用顯著，通過與心肌基質細胞衍生因子-1（SDF-1）一起促進心肌梗死內的心臟干細胞動員和心肌修復；在心衰中，通過功能性上調誘導血管生成，建立側支循環保護心??；通過促進NO、PGI2的生成，共同發揮參與血管內皮修復、保護內皮功能、抑制平滑肌細胞增殖的作用，延緩心衰進展；通過其在血栓調控中的雙重作用，改變凝血機制，使凝血與抗凝機制在心衰病程中趨于平衡[28]。IL-6是炎癥因子之一。研究發現，長期持續的IL-6信號會使心肌收縮力下降，左室增大，肥大基因發生逆轉，誘發心衰，此過程為IL-6結合IL-6受體后，激活信號轉導受體復合物gp130，該復合物與IL-6受體結合產生的下游信號，通過RAS-MAPK、JAK-STAT或PI3K通路，參與心血管疾病的發生發展[29]。TNF是炎性反應相關的細胞因子，分為TNF-α、 TNF-β 兩種，TNF-α 是最有效的促炎細胞因子之一，被選作細胞因子靶向入路的首要靶點。研究表明TNF-α在心臟疾病中體現出復雜性的特征，更多地發揮對心臟的保護作用，機制可能與缺氧狀態下TNFR2的高表達促進心肌細胞的增殖相關[30]。TP53作為一種轉錄因子，可調節許多負責DNA修復、細胞代謝與遷移、血管的生成與衰老和凋亡基因的表達。除抑制腫瘤生成外，還可以作為成纖維細胞轉化為內皮細胞的開關，減少心臟病發作后形成的瘢痕，進而改善心功能[31]。

KEGG富集分析結果顯示，與參竹心康方治療CHF密切相關的通路主要包括：PI3K-Akt 信號通路、JAK-STAT信號通路、鈣信號通路、cAMP信號通路、cGMP-PKG信號通路等。P13K-Akt通路對于調節心肌細胞的凋亡、代謝、減少氧化應激及血管再生等具有重要作用，研究表明，PI3K 的啟動可以募集Akt并促進其磷酸化，活化后的Akt通過多種途徑增強血管生成、抑制細胞凋亡因子、調節鈣離子濃度，對心肌細胞的凋亡起到抑制作用[32-33]。JAK-STAT 信號通路在心臟病理生理學中起核心作用。JAK-STAT 信號傳導與壓力過載誘導的心臟肥厚和重塑、缺血預處理和缺血/再灌注誘導的心臟功能障礙相關。STAT3作為STAT的家族組分之一是JAK的重要底物，具有抗炎、抗凋亡的作用[34]，其發揮作用的機制為心肌缺血期間STAT3的磷酸化增加，促使凋亡相關基因bax及caspases的表達增加[35]。眾多研究表明，在心力衰竭這一疾病進程中會出現鈣信號通路的異常，隨著舒張期肌漿網功能失常，鈣離子會大量流漏，鈣離子穩態失常，導致心肌收縮力降低，引發心臟重構。cAMP通過β-AR信號傳遞產生，并通過AMP水解酶磷酸二酯酶（PDE）抑制，cAMP的增加導致cAMP依賴性蛋白激酶（PKA）和Epac的激活，研究表明，這些蛋白質可以激活鈣處理蛋白、RyRs和SERCA2a，由此達到維持心肌鈣穩態及心肌收縮舒張功能、抑制心肌細胞凋亡、減輕心肌損傷的作用。[36]。cGMP-PKG信號通路對心臟收縮與舒張功能具有調控作用，進而對心室重構產生影響，這一作用通過調節鈣離子濃度來實現[37]。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學方法對參竹心康方治療慢性心力衰竭過程中的機制進行探索。通過對活性成分、作用靶點及信號通路的研究，推測出參竹心康方可能是通過復方中槲皮素、山奈酚、木犀草素、黃芩苷、異鼠李素等關鍵活性成分，結合AKT1、VEGFA、IL6、TNF、TP53等 核 心 靶 點，通 過 調 控PI3K-Akt、JAK-STAT、鈣、cAMP、cGMP-PKG 等信號通路來發揮對慢性心力衰竭的治療作用。這體現出參竹心康方多通路、多靶點聯合作用的特點，為今后深入研究其藥理作用提供方向和參考，預測結果有待細胞及動物實驗等進一步驗證。