涼血解毒化瘀湯治療肝衰竭的作用機制*

陸星宇，李盼，楊晶，張茜茜，彭建平

1 湖南中醫藥大學 湖南長沙 410208

2 湖南中醫藥大學第一附屬醫院 湖南長沙 410000

肝衰竭是因多種因素造成的肝細胞嚴重損害，導致肝臟出現嚴重功能障礙，并在臨床表現出現以黃疸、腹水、肝性腦病、肝腎綜合征、感染等癥狀[1]。肝衰竭在中醫學中屬于肝瘟范疇，古代醫家對肝衰竭的一系列臨床癥候群的病因病機有一定的見解。古代醫學認為肝衰竭是因為外感疫癘邪毒，同時內有濕熱、瘀血、痰濁。我院諶寧生教授提出肝衰竭主要的發生發展的原因主要在于“毒”與“瘀”，并且提出肝衰竭不僅病情進展快，且病情易發生改變，在疾病發生發展過程中，易耗傷營血，所以在治療肝衰竭時，創立了涼血解毒化瘀湯著重于解毒化瘀[2]。經過多年臨床實踐，我院孫克偉教授在黃疸的辨證基礎上，提出了肝衰竭以“陽黃-陰陽黃-陰黃”的辨證方法[3]。在臨床中，涼血解毒化瘀湯在治療肝衰竭疾病時也得到了廣泛的應用，但其具體作用機制尚未明確。本文根據中藥復方及其靶點的特性，通過網絡藥理學及分隊對接驗證的方法，對涼血解毒化瘀湯治療肝衰竭的作用機制進行分析，旨在為進一步研究提供新的研究思路和方向。

材料與方法

1 涼血解毒化瘀湯的活性成分及其作用靶點篩選

利用中藥系統藥理學數據庫分析平臺（TCMSP），檢索涼血解毒化瘀湯中的藥物赤芍、丹參、虎杖、茵陳、梔子、大黃、白術的活性成分，因藥物進入人體的吸收途徑，通過藥物動力學選取以口服生物利用度（OB） ≥ 30%、類藥性（DL） ≥ 0.18 為篩選標準，進行涼血解毒化瘀湯的活性成分及其作用靶點進行篩選；再通過Uniport數據庫對已認證的人類基因對蛋白質的作用靶點規范化。

2 肝衰竭疾病基因靶點篩選

通 過 Genecards數 據 庫 以“liver failure”“liver injury”對疾病基因靶點進行篩選。并通過Genecards數據庫中Score值選取Score值>中位數以上的靶點作為肝衰竭的潛在靶點；再通過關鍵詞在TTD數據庫中篩選，將檢索結果與Genecards數據庫篩選后的潛在靶點結果合并，刪除重復基因靶點得到肝衰竭的相關靶點。

3 “ 活性成分-疾病基因”共同基因篩選及其網絡構建

利用 CytoScape3.8.2構建“活性成分-疾病靶點”網絡圖，使用Cyto-Scape中的Network Analyzer功能進行網絡拓撲分析，根據degree值及相互作用關系設置節點的大小。

4 PPI網絡構建

將所獲取的交集靶點信息導入String數據庫，并將物種設定為Homo sapiens，其余參數設為默認值，得到PPI網絡，將PPI網絡導入CytoScape3.8.2，利用內置 cytoNCA 插件對 BC、CC、DC、EC、LAC 進行兩次打分，根據得分大于中位值的基因，篩選出PPI的核心基因。

5 GO功能注釋及KEGG通路富集分析

運用R語言及Bioconductor平臺對基因進行編碼，并通過利用Bioco-nductor 平臺的DOSE，clusterProf-iler，pathview 數據包借助R語言繪制GO功能注釋及KEGG通路富集分析圖。

6 分子對接驗證

根據篩選出的核心靶點及活性成分，利用PDB數據庫獲得相應的蛋白結構，使用Autodock_vina 軟件對核心靶點與活性成分進行分子對接驗證。

結 果

1 涼血解毒化瘀湯的活性成分及其作用靶點篩選

利用中藥系統藥理學數據庫分析平臺（TCMSP）以OB≥30%，DL≥0.18為標準及ADME篩選，共得到符合條件的活性成分121個，其中白術4個、赤芍14個、大黃10個、丹參59個、虎杖10個、茵陳13個、梔子12個，根據其活性成分來源對其重命名，比如澤蘭黃醇素來源于大黃，重命名為DH1；大黃素甲醚葡糖甙同樣來源于大黃，重命名為DH2，以此類推。針對其多種藥物共有的核心成分，其中β-谷甾醇為赤芍、大黃、虎杖、茵陳、梔子共同成分，命名為A；黃芩素為赤芍、丹參共有，命名為A1；兒茶素為赤芍、虎杖共有，命名為A2；豆甾醇為赤芍、梔子共有，命名為A3；油酸乙酯為赤芍、梔子共有，命名為A4；葡萄糖苷為大黃、虎杖共有，命名為B；大黃酚為大黃、虎杖共有，命名為B1；蘆薈大黃素-8-葡萄糖苷為大黃、虎杖共有，命名為B2；木犀草素為丹參、虎杖共有，命名為C1；異歐前胡內酯為丹參、梔子共有，命名為C2；槲皮素為虎杖、茵陳、梔子共有，命名為D。對已獲取的成分八點整合篩選后，共得到2277個作用靶點，刪除重復靶點后可獲得中藥靶點共247個見表1。

表1 涼血解毒化瘀湯靶點

2 肝衰竭疾病基因靶點篩選

通 過 Genecards數 據 庫 以“liver failure”“liver injury”篩選獲得靶點11962個，其最高Relevance score為 73.20，最 低 Relevance sco-re為 0.11，選 取Score值>中位數2.83以上的靶點；再通過關鍵詞在TTD數據庫中篩選，將檢索結果與Genecards數據庫篩選后的潛在靶點結果合并，刪除重復基因靶點得到6025個肝衰竭基因靶點。

3 “ 活性成分-疾病基因”共同基因篩選及其網絡構建

將獲得中藥活性成分及肝衰竭疾病基因靶點取交集，得到共同靶點201個。利用 CytoScape3.8.2構建“活性成分-疾病靶點”網絡圖見圖1，使用其內置插件Network Analyzer進行拓撲分析，Degree排名前5的活性成分見表2。

表2 涼血解毒化瘀湯有效組分對應的前10位靶點

圖1 活性成分-疾病靶點

4 PPI網絡構建

利用CytoScape3.8.2內置插件c-ytoNCA第一次 打 分 得 BC（b-etweenness）≥ 58.73218043，CC（closeness） ≥ 0.515625，DC（degree） ≥ 32，EC（eigenvector） ≥ 0.045051977，LAC（local average connectivity-based method） ≥ 20.45714286；第 二次 打 分 得 BC≥ 15.29512971，CC≥ 0.781609195，DC≥ 49，EC≥ 0.119799711，LAC≥ 40.28；根據兩次得分>中位值篩選，共獲得網絡核心基因共30個見圖2。

圖2 PPI核心網絡

5 GO功能注釋

運用R軟件及Bioconductor平臺將涼血解毒化瘀湯-肝衰竭交互靶基因進行GO數據庫富集分析，按照P<0.05為標準進行篩選，根據P值從小到大分別選取分子功能MF、生物學過程BP、細胞成分CC前10條通路繪制GO通路圖見圖3。由圖可知涼血解毒化瘀湯和肝衰竭的共同靶點主要集中分布于膜筏、蛋白激酶復合物、質膜筏、突觸后膜、突觸膜、細胞器外模、線粒體外模等細胞組分中，通過RNA聚合酶II-特異因子結合、脫氧核糖核酸-結合轉錄、核受體活性配體-激活、轉錄因子活性蛋白酶結合、轉錄因子結合、細胞因子受體結合、細胞因子活性、類固醇激素受體等方式參與對異生素、脂多糖、細菌源性分子及氧水平的反應等生物進程，從而發揮涼血解毒化瘀湯治療肝衰竭的作用。

圖3 GO分子功能注釋

6 KEGG富集分析

運用R軟件及Bioconductor平臺將涼血解毒化瘀湯-肝衰竭交互靶基因進行 KEGG數據庫富集分析，設置P< 0.05為標準進行篩選，根據P值，從小到大選取前20條通路繪制KEGG信號通路圖見圖4。

圖4 KEGG富集分析

由圖可知涼血解毒化瘀湯核心靶點主要富集于AGE-RAGE、IL-17、HIF-1、TNF、PI3K-Akt、FoxO、C-型凝集素受體等多條通路，表明涼血解毒化瘀湯主要通過調控以上多條通路發揮治療肝衰竭的作用。

7 分子對接驗證

為了驗證涼血解毒化瘀湯與相關靶標的關系及其作用機制，本研究選擇了相關度高的10個靶點分別和涼血解毒化瘀湯中的3個有效組分STAT3、CASP3、IL6分別進行進行分子對接，分子對接結合自由可顯示分子間的結合能力以及相互作用能力見表3。本位選取槲皮素和丹參酮分別與STAT3、CASP3、IL6做分子對接結果可視化見圖5。

表3 分子對接自由功能

圖5 分子對接可視化

討 論

本研究通過運用網絡藥理學及分子對接驗證探討涼血解毒化瘀湯治療肝衰竭的作用機制。通過研究結果可知槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、豆甾醇、山柰酚、丹參酮等是治療肝衰竭的核心成分。TP53、IL6、TNF、STAT3等靶點是肝衰竭疾病治療的重要靶點。基于GO和KEGG富集分析可知，其中AGERAGE信號轉導途徑、IL-17信號通路、HIF-1、TNF信號通路及脂質代謝與肝衰竭的發生發展有著密切關系。

現代醫家諶寧生教授提出肝衰竭病機關鍵在于“毒”“瘀”，在治療時提出重在解毒，貴在化瘀的觀點。由表2可知，赤芍主要核心成分為β-谷甾醇、豆甾醇、黃芩素等，方中赤芍入肝經，清熱涼血，活血化瘀，臨床上在治療肝衰竭時也多重用赤芍，阻斷了肝細胞進一步受損[4]。茵陳的主要核心成分是槲皮素、β-谷甾醇等，方中茵陳清熱利濕，為退黃之要藥。虎杖的主要核心成分是槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素等，方中虎杖清熱利濕。虎杖與茵陳配用有明顯的抗菌、抗病毒及保肝利膽作用[5]。丹參的主要核心成分為木犀草素、丹參酮、鼠尾草酚酮等，方中丹參清熱利血，使血脈通暢，瘀散結消。丹參可改善微循環增強肝臟血流量促進肝細胞修復與再生[5]。梔子的主要核心成分是槲皮素、β-谷甾醇，方中梔子清熱利濕，涼血解毒。方中同時運用大黃瀉火通便，利肝膽濕熱，清除腸道內毒素；白術益氣健脾。全方以涼血化瘀、清熱解毒為宗旨，注重從肝衰竭“毒”“瘀”角度入手，從根本上治療肝衰竭。

槲皮素可以通過抑制AGE-RAGE信號途徑進而抑制 NF-κB、STAT1、cAMP、MAPK 等多條信號通路調控抑制iNOS的轉錄表達及NO釋放，達到抑制炎癥反應的作用從而抑制細胞凋亡及組織損傷[6]；其次槲皮素還可通過抑制HMGB1減少線粒體途徑中細胞內活性氧（ROS）的產生和凋亡反應，從而達到保護L02細胞免受d-半乳糖胺誘導的細胞損傷[7]；槲皮素及β-谷甾醇具還可通過減輕CCL4誘導的氧化應激，激活Nrf2/Keap1信號通路產生細胞保護酶NQO1緩解CCL4誘導的肝損傷[8]。β-谷甾醇不僅具有抗氧化，抗炎的作用，同時可以參與免疫調節，可通過誘導HepG2/ SMMC-7721細胞凋亡，抑制D-半乳糖胺及脂多糖誘導的肝損傷[9]。木犀草素可通過抑制TXNIP-NLRP3炎癥小體、TNF-α、IL-10和IL-6的產生改善脂多糖誘導的肝損傷[10]；還可通過下調對乙酰氨基酚誘導的硝基酪氨酸形成和內質網應激減少肝損傷中存在抗氧化、抗炎和抗雌激素受體應激特性[11]。豆甾醇可通過打開線粒體通透性轉換孔、激活線粒體ATP酶（mATPase）活性和釋放細胞色素c誘導線粒體依賴性凋亡[12]。山奈酚調節內質網應激-Grp78-CHOP信號通路，抑制p-JNK和Endo G蛋白來抑制乙酰氨基酚誘導肝細胞凋亡以達到肝細胞的保護作用[13-14]；還可以通過抑制 NF-κB 途徑，減少炎癥因子的產生從而達到減輕肝細胞凋亡[15]。

在核心PPI中，我們可知 TP53、IL6、TNF、STAT3等靶點發揮作用。STAT3經過IL-6的刺激磷酸化進入細胞核，參與基因轉錄，促進Th17細胞的增殖與分化，而Th-17細胞表達為IL-17因子造成肝衰竭[16]。TNF可以誘導細胞因子IL-6、IL-8等炎癥因子的產生，進而誘導肝細胞的炎性反應，從而促使肝衰竭的發生[17]，TNF可以通過誘導炎癥反應，同時與FAS死亡受體結合，可以激活凋亡起始物caspase-8，從而誘導細胞死亡；還可產生內毒素血癥，誘導產生iNOS迅速升高等多種途徑誘導肝臟炎癥及損傷[18-20]。

AGE-RAGE信號轉導途徑的相互作用可造成一系列的炎癥反應從而引起細胞凋亡及組織損傷，是肝衰竭形成的重要機制之一。RAGE是目前研究最多的AGE受體之一，其在許多細胞表面均有表達[21]。AGE通過與RAGE的結合從而激活NF-κB[22]。NF-κB具有顯著的促進炎癥的特性，同時也是細胞內炎癥反應的重要通路之一，其可誘導大量炎癥因子如TNF-α、iNOS、IL-1的產生從而加重肝細胞凋亡，而炎癥因子的增加可進一步促進NF-κB的產生，從而形成惡性循環[23-24]；乙二醛酶的活性降低可以導致偶聯蛋白-2減少從而引起線粒體功能障礙相關的氧化應激反應，增強肝臟蛋白質糖基化，加重了炎癥誘導的肝損傷，通過rRAGE阻斷AGE/RAGE結合能夠完全消除與炎癥損傷增加相關的線粒體功能障礙[25]，AGE和RAGE的可通過多元醇途徑、蛋白激酶 C等途徑結合引起細胞內活性氧（ROS）的產生，從而激活絲裂原活化蛋白激酶和NF-κB信號，產生炎癥因子，引起細胞凋亡。本研究結果表明，涼血解毒化瘀湯可能通過參與調節AGE-RAGE的信號通路治療肝衰竭[26]。

小 結

經過本研究的分析可知，涼血解毒化瘀湯可通過多成分、多靶點、多通路治療肝衰竭，根據現有的研究數據表明槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、豆甾醇、山柰酚、丹參酮等可能是涼血解毒化瘀湯治療肝衰竭的主要成分，猜測其主要可能通過多通路調節AGE-RAGE信號轉導途徑所引起的炎癥反應、氧化應激反應，以及改善線粒體質量來抑制肝細胞凋亡。同時，通過運用分子對接探討涼血解毒化瘀湯核心成分與肝衰竭疾病的核心靶點的結合能力，可以為涼血解毒化瘀湯治療肝衰竭提供了一定的理論依據。

但在相關研究的過程中，發現基因TP53在肝衰竭疾病發生發展中的作用機制尚未明確，在接下來的臨床及科研研究中，可以繼續探討并驗證基因TP53在肝衰竭發生發展中的作用機制，是否可以通過調控基因TP53從而調控其相關的生物進程達到治療肝衰竭的目的。

通過以上所述，結合網絡藥理學的研究可知，涼血解毒化瘀湯是通過多成分、多靶點、多通路達到治療肝衰竭的效果。本次研究僅為涼血解毒化瘀湯治療肝衰竭的機制進一步研究提供了新思路和新方法，為涼血解毒化瘀湯的臨床應用提供了科學依據。但本研究未加入藥理學實驗驗證，結果具有一定的局限性。