景鶴養心舒治療慢性心力衰竭的作用機制*

胡華鵬，朱金燕，李杰平，趙星，劉明

1 云南中醫藥大學 云南昆明 650500

2 昆明市中醫醫院 云南昆明 650051

3 昭通衛生職業學院 云南昭通 657099

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是因心肌細胞缺血缺氧及血流動力學負荷過重等引起心肌細胞損害而導致心臟功能異常的一種心血管疾病，對患者生理、心理健康造成了很大影響[1]。據相關研究[2-5]，中國、美國、歐洲等各國CHF患者基數大，預后差，具有較高的致殘率及致死率。目前治療CHF取得了很大的進展，在改善CHF患者再住院率、死亡率及生活質量等方面有了很大的突破，但其臨床療效不能達到人們的預期[6]。

景鶴養心舒是云南省名中醫劉明教授基于中醫辨證論治的理論體系，結合多年的臨床經驗，在長期的臨床實踐中反復驗證擬定，在治療慢性心力衰竭取得了較好的臨床療效。為了深入探究景鶴養心舒治療慢性心力衰竭的作用機制，擬通過網絡藥理學和分子對接從細胞及分子層面對該藥進行剖析，為進一步開展具體的藥理及機制研究提供一定的理論依據。

資料與方法

1 方藥組成

景鶴養心舒組方：紅景天、仙鶴草、葶藶子、桂枝、茯苓、丹參、甘草。

2 數據庫與軟件

TCMSP 數 據 庫（https：//old.tcmsp-e.com/）；TCMID 數據庫（http：//47.100.169.139/tcmid/）；Gene-Cards數據庫（https：//www.genecards.org/）；Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）；SwissTargetPrediction數 據 庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）；Dis-GeNET 數 據 庫（https：//www.disgenet.org/）；venny圖（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）；STRING 數 據 庫（https：//cn.string-db.org/）；DAVID Bioinformatics Resources數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）；PDB 數 據 庫（https： / /www.rcsb.org /）； Cytoscape3.9.1軟 件；Pymol軟 件；Autodock軟 件；Excel 2014軟件。

3 方法

3.1 景鶴養心舒相關靶點篩選 檢索TCMSP數據庫，分別以“仙鶴草、葶藶子、桂枝、茯苓、丹參、甘草”為關鍵詞，以藥物類藥性（DL）≥0.18和口服生物利用度（OB）≥30%為篩選條件[7]，得到景鶴養心舒中上述6味中藥的有效成分及相關靶點的蛋白名稱，再通過Uniprot數據庫查找相應的“Homo sapiens”基因名稱。以“HONG JING TIAN”為關鍵詞在TCMID數據庫中查找紅景天的有效成分，再通過SwissTarget-Prediction數據庫以Probability>0.02為篩選條件檢索出相對的基因靶點。

3.2 CHF相關靶點篩選 檢索GeneCards數據庫、DisGeNET 數據庫，以“chronic heart failure”為關鍵詞搜索相關基因靶點，并通過venny圖篩選出兩個數據庫中的相同基因靶點。

3.3 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖構建 使用venny圖查找景鶴養心舒靶點與CHF靶點的交集，并篩選出景鶴養心舒中作用于該交集靶點的成分。將篩選出的成分與交集靶點一一對應并導入Cytoscape3.9.1軟件中，構建景鶴養心舒有效成分與CHF靶點的關系圖。

3.4 成分-疾病靶點PPI網絡構建 為進一步研究景鶴養心舒治療CHF的藥理機制，本研究通過STRING在線平臺輸入景鶴養心舒和CHF的交集靶點，進行蛋白—蛋白相互作用分析，選取互作分數≥0.4。

3.5 景鶴養心舒成分-CHF靶點功能與通路的富集分析 為了說明靶蛋白在治療CHF中的生物學過程、分子功能、細胞組成、通路分析及富集情況，進行GO富集分析和KEGG富集分析。將景鶴養心舒和CHF的交集靶點輸入DAVID數據庫，選擇物種“Homo Sapiens”（P<0.05），進行富集分析。

3.6 核心活性成分與關鍵靶點的分子對接驗證 為驗證篩選出的核心成分作用于CHF潛在關鍵靶點的準確性，將“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖篩選出的核心成分與PPI網絡中得到的關鍵靶點進行分子對接。在 TCMSP 數據庫中下載核心成分的2D 分子結構，從PDB數據庫下載關鍵靶點3D結構，所得成分與靶點蛋白結構均導入Pymol軟件進行脫水，并保存為pdb格式，再通過 Autodock 軟件進行預處理及分子對接，運用Pymol軟件進行輸出優化。

結 果

1 景鶴養心舒有效成分的篩選及靶點預測

共篩選出景鶴養心舒中有效成分182個（其中紅景天26個，去除無靶點以及無人源靶點化合物后21個；仙鶴草5個，去除無靶點以及無人源靶點化合物后5個；葶藶子12個，去除無靶點以及無人源靶點化合物后9個；桂枝7個，去除無靶點以及無人源靶點化合物后6個；茯苓15個，去除無靶點以及無人源靶點化合物后6個；丹參65個，去除無靶點以及無人源靶點化合物后59個；甘草92個，去除無靶點以及無人源靶點化合物后85個。共191個，刪除重復項后共182個），對應基因靶點共3380個，刪除重復項后共499個。

2 CHF相關靶點的獲取

GeneCards數據庫中共檢索出CHF基因靶點10596個，DisGeNET數據庫中共檢索出CHF靶點223個，通過venny圖篩選出相同靶點199個。

3 藥物-成分-靶點-疾病網絡圖的構建

通過venny圖，景鶴養心舒作用靶點與CHF相關靶點交集42個，見圖1，可視化分析見表1，這些即為景鶴養心舒作用于CHF所涉及的靶點。選出景鶴養心舒中能夠作用于這42個靶點的有效成分，共有紅景天16種、仙鶴草4種、葶藶子7種、茯苓4種、桂枝3種、丹參44種，甘草73種，景鶴養心舒治療CHF的有效成分共142種。景鶴養心舒“藥物-有效成分-靶點-疾病”關系見圖2，可視化結果顯示，景鶴養心舒有效成分中Quercetin（槲皮苷）和Kaempferol（山奈酚）的出度較高，見表2，作用靶點中誘導型一氧化氮合酶和二肽基肽酶4的入度較高，見表2，表3。

表1 景鶴養心舒化合物靶點與CHF相關靶點共有交集

表2 出度最高的5種有效成分

表3 入度最高的5個靶點基因

圖1 景鶴養心舒靶點與CHF靶點關系

圖2 “中藥-疾病-有效成分-靶點”網絡

4 蛋白質－蛋白質相互作用（PPI）網絡

通過STRING數據庫，得到景鶴養心舒42個靶點基因間相互作用，利用Cytoscape繪制蛋白—蛋白互作（PPI）網絡圖，見圖3，可視化分析后自由度最高的5種分別為 IL6、TNF、NOS3、VEGFA、ACE，見表4。

圖3 PPI網絡Cytoscape

表4 自由度最高的5種靶基因

5 靶點功能與通路的富集分析

GO功能富集分析得到768個條目（P<0.05），其中生物過程273個、分子功能35個、細胞成分22個，3個部分各取前10個條目建立柱狀圖，見圖4。柱狀圖顯示，生物學過程包括細胞因子介導的信號通路、缺氧反應、基因表達的正調控、炎癥反應、G蛋白偶聯受體信號通路、藥物反應、凋亡過程的正調控、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、基因表達的負調控、細胞增殖的正調控。細胞組分有質膜、膜的組成部分、質膜的組成部分、細胞外間隙、細胞外區、膜、內質網、內質網膜、厄爾表面、突觸前膜的內胚層成分。分子功能涉及蛋白質結合、相同蛋白結合、蛋白質同源二聚化活性、蛋白質異二聚活性、酶結合、G蛋白偶聯受體活性、鋅離子結合、細胞因子活性、轉錄因子結合、大分子復合物結合。

圖4 景鶴養心舒治療CHF GO富集分析

KEGG通路富集分析得到60個條目（P<0.05），選擇前20個條目建立氣泡圖，見圖5。這些通路包括流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路、AGE-RAGE信號通路、鈣信號通路、脂質與動脈粥樣硬化通路、HIF-1信號通路、代謝途徑、cGMP-PKG信號通路、糖尿病心肌病、PI3K-Akt信號通路、cAMP信號通路、AGERAGE信號通路、松弛素信號通路等，通過氣泡圖也可以看出流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路、AGERAGE信號通路為最重要兩條通路。

圖5 景鶴養心舒治療CHF KEGG富集分析氣泡

6 核心活性成分與關鍵靶點的分子對接驗證

以篩選出的5種核心成分與5種關鍵靶點進行分子對接，結果分子對接所得結合能均小于-5，提示核心活性成分與靶點均具有較好的結合活性，分子對接結果見表4，其中β-谷甾醇與NOS3、β-谷甾醇與ACE、山奈酚與ACE結合力較為顯著，見圖6。

圖6 對接結果示意

表4 核心活性成分與關鍵靶點對接結合能

討 論

本研究系統分析了景鶴養心舒的活性成分及其治療CHF的作用靶點，通過構建“中藥－疾病－有效成分－靶點”關系圖，可推測槲皮苷、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、異鼠李素這5種成分可能是景鶴養心舒治療CHF的最重要化學物質，誘導型一氧化氮合酶（NOS2）、二肽基肽酶 4（DPP4）、β-2 腎上腺素受體（ADRB2）、毒蕈堿乙酰膽堿受體M3（CHRM3）、Mu型阿片受體（OPRM1）靶點是景鶴養心舒作用于CHF最主要的靶點。槲皮苷是一種黃酮類單體化合物，可抑制促進細胞凋亡和心臟肥大的鈣調蛋白磷酸酶的活性，可抑制炎癥反應，抵制細胞發生氧化應激[8-9]。山奈酚屬于黃酮類化合物，能促進缺氧心肌細胞增殖、降低活性氧水平、抑制缺氧心肌細胞凋亡和抑制自噬，也有抗炎的作用[10]。木犀草素是屬于黃酮類化合物，能抗氧化應激及抑制炎癥反應，抑制心肌細胞線粒體損傷，抑制外周血淋巴細胞DNA損傷[11-12]。β-谷甾醇是一種天然多酚羥酸類化合物，能緩解氧化應激損傷，改善炎癥反應，也可通過下調ERK1/2信號通路，上調Bcl-2/Bax信號通路，抑制心肌細胞凋亡[13]。異鼠李素是一種植物類黃酮，通過抑制心肌細胞線粒體的調亡，從而阻止細胞自噬的發生[14]。DPP4可作用于干細胞，調控心肌細胞的再生；可作用于心肌膠原纖維表達；與炎癥細胞浸潤、細胞因子產生相關[15-16]。ADRB2對正常心肌細胞無太大影響，心衰細胞中的ADRB2的增加導致環磷酸腺苷的區域化，來促進心肌細胞的存活，增強心肌細胞抗損傷、抗缺血和缺氧能力，除此以外，ADRB2在確保心衰細胞存活率的基礎上增加心肌細胞的收縮幅度[17]。NOS2、CHRM3、OPRM1作為CHF的靶點，也是景鶴養心舒治療CHF的主要靶點之一，目前文獻中暫未發現對心血管方面的確切研究。

通過PPI網絡結果可看出白細胞介素-6（IL6）、腫瘤壞死因子（TNF）、內皮型一氧化氮合成酶（NOS3）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、血清血管緊張素轉化酶（ACE）是景鶴養心舒作用于CHF的關鍵靶點。TNF、IL6均作為重要的炎癥因子，通過刺激促炎白細胞的募集，促進心肌損傷、纖維化重塑和功能障礙已廣泛參與心力衰竭的發病機制[18]。NOS3主要存在于血管內皮細胞，在催化劑的催化下可生成內皮細胞衍生性一氧化氮，進而引起鳥苷酸環化酶激活積聚，游離Ca2+減少，最終導致平滑肌細胞松弛、血管擴張[19]。VEGFA是調節血管功能的關鍵因子，能夠與血管內皮細胞上的相關受體結合，發揮促進新生血管形成等功能[20]。ACE與血管的收縮擴張功能密切相關，2018中國心力衰竭診斷和治療指南提出所有射血分數降低型心力衰竭患者均應使用ACE拮抗劑[21]。

從GO富集分析得出景鶴養心舒作用于CHF的生物學過程主要涉及炎癥反應、缺氧反應、基因表達的正負調控、細胞增殖的正調控、調亡過程的正調控、藥物反應等。細胞組分包括質膜、膜的組成部分、質膜的組成部分、細胞外間隙、細胞外區、內質網、內質網膜、厄爾表面、突觸前膜的內胚層成分等。分子功能涉及相同蛋白結合、蛋白質同源二聚化活性、蛋白質異二聚活性、酶結合、G蛋白偶聯受體活性、鋅離子結合、細胞因子活性、轉錄因子結合、大分子復合物結合等。

通過KEGG富集分析可知景鶴養心舒治療CHF的信號通路主要涉及以上所述20種通路，流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路、AGE-RAGE信號通路為景鶴養心舒治療CHF的主要通路。其中流體剪切應力與動脈粥樣硬化均可影響血管內皮細胞功能，進而影響到NO的產生及炎癥因子的釋放[22]。AGERAGE信號通路可通過其對動脈僵硬度、動脈粥樣硬化、線粒體功能障礙、氧化應激、鈣穩態和細胞骨架功能的影響來調節CHF的發病機制[23]。此外，HIF-1信號通路主要涉及涉及活性氧的產生[24]。cGMPPKG信號通路可控制各種心肌特性，包括細胞生長和存活、間質纖維化、內皮通透性、心肌收縮力和心血管重塑[25]。糖尿病心肌病的途徑主要表現在心肌細胞的氧化應激、炎癥、調亡和神經體液機制等方面[26]。PI3K-Akt信號通路通過改變呼吸鏈終端酶細胞色素C氧化酶的活性來保護線粒體的功能，進而阻止細胞調亡[27]。壓力超負荷可引起心肌細胞內cAMP濃度升高，同時，cAMP表達減少會導致Ca2+的轉運異常，從而導致心肌的舒縮功能障礙[28-29]。

最后，分子對接結果顯示了景鶴養心舒中的核心成分與該藥治療CHF的關鍵靶點之間有良好的對接，其中β-谷甾醇與NOS3、β-谷甾醇與ACE、山奈酚與ACE結合力較為顯著。

結 論

綜上所述，景鶴養心舒治療CHF作用機制可能是該藥中槲皮苷、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、異鼠李素這5種核心成分作用于IL6、TNF、NOS3、VEGFA、ACE等關鍵靶點，通過流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路、AGE-RAGE信號通路等通路發揮抑制心臟重塑、延緩心肌細胞凋亡、調節氧化應激、影響炎性因子、改善心臟收縮舒張功能、減輕心臟后負荷等作用。但由于中藥組方的復雜性，景鶴養心舒治療CHF是否通過上述機制發揮作用還需后續的基礎試驗進一步驗證。