石見穿治療小鼠腎結石的活性部位篩選及其化學成分分析*

劉漫 ，蒲蓮蓮 ，楊穎 ，劉陶世 ，嵇晶 ，程建明

1 南京中醫藥大學藥學院 江蘇南京 210023

2 江蘇省經典名方工程研究中心 江蘇南京 210023

腎結石是腎臟中沉積的礦物質結晶，臨床上最常見的是草酸鈣結石，約80%的腎結石是由草酸鈣晶體發展而成[1]。腎結石會造成排尿困難，引起劇烈腰痛甚至血尿。其在全世界的患病率呈上升趨勢，嚴重威脅患者的健康和生活質量。

目前，腎結石的主要治療方式包括手術治療和服用解痙、抗炎藥物[2]。但患者術后結石殘留率及復發率仍居高不下。有研究表明用藥不當也會引發腎結石[3]會不同程度的對腎組織造成損傷。中醫藥療法通過對因療法和對癥療法相結合，通過改善機體體質的同時促進結石排出體外，不會對腎組織造成不良反應，與西醫治療相比具有一定優勢和開發潛力。

石見穿又名華鼠尾草、小丹參、紫參。為唇形科植物鼠尾草（Salvia chinensis benth） 的干燥地上部分，味辛；苦；性微寒。具有清熱利濕，消腫利水的作用。現有研究表明石見穿含有酚酸類[4]、三萜類[5]、黃酮類[6]等活性成分。近年來石見穿作為治療結石中藥被廣泛應用于各組方中，但目前其抗結石作用筆者尚未見國內外相關文獻報道。因此，本研究采用乙醛酸鹽誘導腎結石法建立小鼠腎結石模型[7]，系統溶劑提取法制備石見穿不同活性部位。運用化學分析與藥理相結合的方法篩選石見穿治療腎結石的活性部位。擴大石見穿的藥效范圍，為后續新藥開發奠定基礎。

材料與方法

1 儀器設備

旋轉蒸發儀（上海 EYELA OSB-2200），酶標分析儀（Infinite F50）；高速離心機（上海安亭 TGL-16G）；切片機（LEiCA RM2016上海徠卡儀器有限公司），包埋機（JB-L5，武漢俊杰電子有限公司），Kromasil-5C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Ultimate 3000高效液相色譜儀（1000 mm×1000mmm×1000 mm）、SIL-20A XR UFLC 儀（日本 島津 公 司）、Triple TOF 5600System MS/MS高分辨三重四極桿飛行時間質譜儀（美國 AB Sciex公司）。

2 化學試劑

甲醇（TEDIA，批號 21080394）、甲酸（阿拉丁，批號 20160412）、乙腈（TEDIA，批號 21070272），95% 乙醇（無錫市亞盛化工有限公司 20220120），石油醚（廣東光華，20130909）乙醛酸溶液（50%水溶液，阿拉丁K2002091），氫氧化鈉（滬試，國藥集團化學試劑有限公司，批號：10019762）生化分析試劑盒：肌酐（Cr）試劑盒，血清尿素氮（BUN） 測試盒。乙醇（國藥集團化學試劑有限公司100092683）、二甲苯（10023418國藥集團化學試劑有限公司）、HE染液（71014460上海經科化學科技有限公司）。

3 實驗動物

ICR小鼠（18～22g）60只雄性，SPF級由杭州醫學院提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（浙）2019-0002。動物合格證編號：20211026Abzz0100000231動物倫理申請單號：202108A009。小鼠飼養于20～25℃、相對濕度40%環境中，自然晝夜節律光照，適應性飼養一周。自由飲水、進食，實驗前及實驗過程中小鼠均以全價顆粒飼料喂養。

4 藥材

石見穿藥材飲片購自安徽亳州市康易飲片有限公司，批號：20210711，產地：江蘇，經南京中醫藥大學藥學院劉訓紅教授鑒定為為唇形科植物華鼠尾草Salvia chinensis Benth 的地上部分。

5 方法

5.1 石見穿各部位樣品的制備 ①石油醚部位的制備：取石見穿飲片適量，用10倍量的石油醚（60～ 90℃）加熱回流提取2次，1 h/次，過濾，合并濾液；濾液減壓濃縮回收溶劑得到浸膏，即為石油醚部位，藥渣備用。②醇部位的制備：將上述藥渣揮去殘留石油醚，用10倍量的95%乙醇加熱回流提取2次，1 h/次，過濾，合并濾液。濾液減壓濃縮回收溶劑得到浸膏即為95%乙醇部位，藥渣備用。③水部位的制備：取②殘留藥渣，揮去殘留乙醇，用10倍量的水加熱回流提取2次，1 h/次，過濾，合并濾液。濾液減壓濃縮回收溶劑得到浸膏即為水部位，制備工藝流程圖見圖1。

圖1 石見穿各部位提取工藝流程圖

5.2 成石液的配制 參考文獻[7]，取50%的乙醛酸溶液1mL加注射用水稀釋至100mL，用適量的NaOH調pH至7.4，得5mg/mL的乙醛酸鹽溶液，即為成石液。

5.3 小鼠腎結石模型的建立及給藥方案 健康小鼠60只，適應性飼養1周后，隨機分成6組，每組10只，即空白組，模型對照組，陽性藥物對照組，石見穿石油醚提取物部位組，石見穿95%乙醇提取物部位組，石見穿水提取物部位組。除空白對照組每天注射生理鹽水外，其余各組均注射成石液，以給藥劑量100mg/Kg、給藥體積0.1mL/10g，連續腹腔注射2周。造模期間觀察小鼠形態變化和監測體重。建模2周后隨機取3只小鼠麻醉后處死解剖，取雙腎浸泡于4%的多聚甲醛溶液，腎組織切片，觀察。

實驗期間各組小鼠自由攝食飲水，采取先造模后給藥的方法。造模2周后，灌胃給予陽性藥物組和石見穿各部位藥物組小鼠相同劑量的相應藥物（石見穿[8]：18.02 g/kg，臨床 4 倍有效量；腎石通顆粒：4.51g/kg），空白組與模型組則灌胃蒸餾水，1次/d，給藥體積均為10ml/kg，連續給藥2周。

6 檢測指標和方法

6.1 腎臟系數 腎臟系數=腎質量（g）/體質量（g）×100%，腎質量為小鼠腎臟的質量；體質量為小鼠的質量。

6.2 血清BUN（血清尿素氮）、Cr（血肌酐）水平 實驗結束后，小鼠眼眶取血，靜置1h后離心取血清，-20℃保存。使用全自動生化分析儀測定BUN（血清尿素氮）、Cr（血肌酐）水平。

6.3 腎組織病理學形態觀察 取右側腎臟4%用多聚甲醛固定，切片染色顯微鏡觀察，病理切片組織學[9]觀察實驗小鼠腎皮質、髓質分界是否清晰，腎小球、腎小管等有無異常改變，腎間質內有無炎癥細胞浸潤及變性、出血等癥狀。通過鈣結晶特異性染色Von Kossa[10]對小鼠腎臟石蠟切片進行染色，電子顯微鏡觀察腎臟組織草酸鈣結晶的分布與數量。

7 石見穿活性部位化學成分的鑒定分析

7.1 供試品溶液的制備 將上述“5.1”項下的浸膏用甲醇稀釋成適宜濃度，10000 r/min 離心 10 min，取上清液，0.22um濾膜濾過，即得供試品溶液。

7.2 色 譜 條 件 Kromasil-5C18色 譜 柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相 0.1% 甲酸（A）- 乙腈（B），梯度洗脫（0～ 6min，5% ～ 10%B；6～ 25min，10%～ 14%B；25～55min，14%～28%；55～70min，28% ～ 38%B；70 ～ 80min，38% ～ 95%B），體積流量1.0 mL/min；柱溫 30℃；進樣量 10 μL，PDA 檢測波長為330nm。

7.3 質譜條件 電噴霧離子源正負離子模式；質量掃描范圍m/z 50～1500；高純度氮氣，離子源溫度600°C；氣簾氣流速40L/min；霧化氣流速55L/min；輔助氣流速55L/min；碰撞能量35V。

7.4 總離子流圖的采集 取“7.1”項下經處理后的石見穿95%乙醇提取部位供試品溶液適量，按“7.2”項下色譜與“7.3”項下質譜條件進樣分析，采集正、負離子模式下的石見穿有效部位總離子流圖。

7.5 化學成分的鑒定分析 使用Peakview 2.0軟件（美國AB SCIEX公司），對采集的質譜數據中的一級質譜碎片信息及精確準分子離子峰進行分析，計算其未知化合物的元素組成和可能的分子式（誤差±5.0×106），對各色譜峰進行初步鑒定。再通過比對SciFinder數據庫、二級質譜碎片信息，結合參考文獻[11-12]進一步確認化學成分及結構。

8 統計學方法

通過 GraphPad Prism 8.3.0軟件進行數據處理，數據以（±s）表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

結 果

1 腎臟系數

與空白組比較，模型組小鼠體質量減輕，腎質量、腎臟系數均增加，具有統計學差異（t=4.15，P=0.0010）提示造模成功。與模型組比較，陽性藥物組、石見穿95%乙醇部位組、水部位組腎臟系數均顯著性降低，表明石見穿對腎結石小鼠的體質量、腎質量、腎臟系數具有一定改善作用，對腎結石小鼠具有一定治療作用。見表1。

表1 石見穿不同部位的ICR小鼠腎臟系數變化（±s，n=8）

表1 石見穿不同部位的ICR小鼠腎臟系數變化（±s，n=8）

注：與空白組比較#P<0.001，與模型組比較，*P<0.05，**P<0.001

組別 劑量/g·kg-1 腎臟重量/g 體重量/g 腎臟系數空白組 － 0.5268±0.0641 40.1445±4.8224 0.0131±0.0005模型組 － 0.4941±0.0312 33.9171±2.4196 0.0146±0.0009#腎石通顆粒組 0.451 0.4564±0.0362 41.0872±0.3504 0.0135±0.0004**石見穿石油醚部位組 1.802 0.4535±0.0236 34.4717±0.9313 0.0143±0.0010石見穿乙醇部位組 1.802 0.4580±0.0535 34.4732±5.1977 0.0134±0.0008*石見穿水部位組 1.802 0.4855±0.0515 35.9375±4.9198 0.0136±0.0006*

2 血清BUN（血清肌酐）、Cr（血肌酐）水平變化

與空白組相比較，模型組小鼠Cr（血肌酐）和BUN（血清肌酐）明顯升高，具有顯著性差異（P<0.001）；與模型組相比較，石見穿95%乙醇部位組和水部位組小鼠血清Cr（血肌酐）和BUN（血清肌酐）水平顯著性降低。表明石見穿95%乙醇部位組和水部位組均有對草酸鈣結石所致受損腎臟修復的作用；其中石見穿95%乙醇組的效果最好，能明顯改善乙醛酸鹽所致小鼠腎損傷。見表2。

表2 石見穿不同部位的ICR小鼠血清Cr、BUN（±s，n=8）

表2 石見穿不同部位的ICR小鼠血清Cr、BUN（±s，n=8）

注：與空白組比較#P<0.001 與模型組比較，*P<0.001

組別 劑量/g·kg-1 Cr/umol·L-1 BUN/pmol·L-1空白組 － 8.91±2.00 672.18±126.35模型組 － 26.86±1.27# 2024.21±127.39#腎石通組 0.451 13.13±1.52* 1126.60±103.25*石見穿石油醚部位組 1.802 23.90±2.14 1515.46±112.01石見穿乙醇部位組 1.802 17.62±1.52* 1102.35±145.24*石見穿水部位組 1.802 18.32±2.66* 1235.72±130.93*

3 腎組織病理學形態觀察

以蘇木精-伊紅（HE）進行小鼠腎組織染色，如圖2所示，顯微鏡下觀察：空白組和腎石通顆粒組小鼠腎臟組織未見異常，腎小球內的毛細血管未見擴張，未見腎小管上皮細胞變性、壞死，未見炎細胞浸潤。模型組小鼠腎組織整體結構異常，可見腎小球明顯萎縮壞死，大量腎小管明顯擴張，組織間質可見大量纖維結締組織異常增生，明顯纖維化，可見明顯炎癥細胞浸潤。石油醚部位組小鼠腎組織整體結構異常，可見腎小管上皮細胞疏松水腫脫落壞死，組織可見炎癥細胞浸潤。乙醇部位組小鼠腎組織整體結構基本正常。腎小管、腎小球未有明顯壞死等變性。水部位組小鼠腎組織整體結構輕度異常，腎小球組織可見少量腎小管上皮細胞脂肪變性。

圖2 腎組織病理學形態（×200）

4 腎組織內病理性鈣沉積情況

圖3所示，顯微鏡下觀察：空白組和陽性藥物組小鼠腎臟組織未見草酸鈣結晶。模型組小鼠腎組織整體結構異常，有大量草酸鈣結晶存在。石油醚部位組小鼠腎組織整體結構異常，存在一定數量草酸鈣結晶。乙醇部位組小鼠腎組織整體結構正常，無草酸鈣結晶。水部位組小鼠腎組織整體結構基本正常，無草酸鈣結晶。見圖3（圖中黑色箭頭為草酸鈣結晶）。

圖3 腎組織內病理性鈣沉積情況（×200）

5 95%乙醇部位化學成分鑒定

采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術對石見穿95%乙醇部位進行全掃，其負離子模式下總離子流圖如圖4所示。根據數據處理方法，進行鑒定分析。在石見穿95%乙醇提取部位中，共鑒定出28個化合物，包括13個有機酸類，如：迷迭香酸、丹參酚酸等；5個三萜類化合物：山楂酸、積雪草酸等；4個黃酮類化合物，如蘆丁、槲皮素；6個其他類成分。各化合物的保留時間（tR）等信息，見表3。

表3 石見穿95%乙醇部位化學成分解析

圖4 石見穿95%乙醇提取部位總離子流

小結與討論

目前認為，腎結石屬上尿路結石，在中醫學中屬“石淋”“砂淋”“血尿”“腰痛”等范疇，其臨床以腰痛尿道刺痛，排砂石為主癥。草酸鈣結石是泌尿系結石中最常見的類型，腎草酸鈣結石患者的草酸鈣結晶在腎小管上皮細胞中黏附形成結石顆粒，所造成的腎小管上皮損傷可進一步導致腎功能損傷，草酸鈣結晶易在受損部位沉積加劇腎臟損傷，如此往復給患者帶來較大困擾和痛苦，嚴重威脅患者的生命健康。因此，對草酸鈣結石進行及時有效的治療顯得十分重要。本研究采用乙醛酸注射法誘導創立腎草酸鈣結石小鼠模型并進行相關研究，研究中發現腎草酸鈣結石小鼠血肌酐、血尿素氮水平升高，提示腎草酸鈣結石可對腎功能造成較為明顯的影響。草酸鈣堆積在腎小管及腎小球中，形成結晶體，阻塞腎小管，并且通過炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡與壞死和纖維化等途徑，造成腎臟損傷。

本研究從石見穿對腎草酸鈣結石引起的腎臟損傷具有“溶石”和修復作用為切入點，對石見穿石油醚部位、95%乙醇部位、水部位進行藥效篩選，得出石見穿95%乙醇部位能夠顯著降低腎草酸鈣結石小鼠血清肌酐、尿素氮水平，并且能夠溶解小鼠腎臟草酸鈣結石。提示該部位有良好的腎損傷修復和溶石作用為擴大石見穿藥效范圍提供了依據。中藥所含成分較多且較為復雜，因而其具體藥效物質基礎以及作用機制不甚明確。口服的中藥可通過吸收入血的成分發揮藥效，因此這些入血成分可能是中藥發揮療效的物質基礎。基于此，后期將對石見穿入血成分進行分析，探討石見穿的入血成分，為更進一步闡明其藥效物質基礎提供參考。