三葉青地上部分水溶性多糖的抗腫瘤作用研究*

龔來覲，李鶴

江西農業工程職業學院 江西宜春 331200

三葉青 Tetrastigma hemsleyanum 為葡萄科崖爬藤屬蔓生植物，主要以塊根入藥。三葉青又名金線吊葫蘆、蛇附子、石抱子等，主產地為浙江、福建、江西等南方地區，其性涼，味微甘、辛，具有清熱解毒、消炎止痛、祛風化痰等功效[1-2]。據報道，三葉青具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤及免疫調節等藥理活性，三葉清塊根可以抑制腫瘤細胞的增殖并誘導各種癌細胞的凋亡[3]。廣泛用于白血病和肺癌、肝癌、胃癌的治療?，F代研究發現，乙醇提取的三葉清黃酮抗腫瘤和抗氧化作用[4]。然而，三葉清水煎劑在傳統民間醫學中被廣泛使用，三葉清水提物中的活性成分，包括多糖，仍然缺乏研究。此外，大多數研究集中于三葉青的塊根，從三葉青葉子中提取的多糖研究報告較少。為了開發藥用資源，本研究旨在從三葉清葉子中提取純化多糖，對其化學性質進行表征。并用H22荷瘤小鼠研究其抗腫瘤作用，對小鼠血清中的細胞因子進行了評價，并對其調節機制進行了研究。

實驗材料與方法

1 試劑與材料

腫瘤壞死因子α（TNF）a、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10、白細胞介素-12、環磷酸腺苷（cAMP）、干擾素 -γ（IFN-γ）、白細胞介素 -1β（IL-1β）和前列腺素E2（PGE2）的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自上海新凡生物科技公司（中國上海）；BCA蛋白檢測試劑盒購自Beyotime biotechnology（中國上海）；脂多糖（LPS）購自美棉生物科技（中國江蘇鹽城）；本研究中使用的其他試劑為分析級試劑，本研究中使用的水是從默克Milli-Q水凈化系統獲得的去離子水。

三葉青的地上由江西大茅山中藥生物科技有限公司提供，經江西農業工程職業學院龔福保教授鑒定。

2 動物

健康雄性昆明小鼠（22±2 g）、ICR 雄性小鼠（25±2 g）和 BALB/c雄性小鼠（22±2 g）購自江西中醫藥大學實驗動物中心。小鼠被安置在溫度為21～23°C、相對濕度為30%～70%、光照/暗照周期為12h的有機玻璃籠中，可以自由獲取食物和水。

3 三葉青地上部分多糖的制備與分析

3.1 多糖的提取與純化 取三葉青地上部分粉末250g，1000mL去離子水80℃提取三次，每次30min，合并，過濾，在4000r/min下離心20min，減壓濃縮，干燥得水溶性部分（WSP）。在濃縮液中加入三倍體積的95%乙醇，4℃放置12h。離心，將沉淀重新溶解在水中，并重復沉淀程序，凍干沉淀得到粗多糖。sevag法脫蛋，脫蛋白樣品上DEAE-Sepharose fastflow柱（2.6cm×30cm），用流速 1.0 mL/min 的 0.2mol/L 、0.5mol/L、1.0mol/L NaCl溶液逐步梯度洗脫。0.2moL/LNaCl溶液洗脫部分過Superdex-200（2.0cm×80cm）色譜柱，去離子水洗脫，獲得純化的多糖為三葉青多糖[5-7]。

3.2 均勻性和分子量測定[8-9]高效凝膠滲透法測多糖的均質性和分子量，以分子量為5kDa、25kDa、50kDa、80kDa、150kDa的右旋糖酐標準物用作標準分子標記物；Waters1525（Waters Ultrahydrogel500 柱），蒸發光散射檢測器；流動相：20mmoL/L醋酸銨溶液等度洗脫，樣品用流動相溶解制備成1mg/mL的溶液，注射體積20μL。

3.3 化學性質及單糖組成分析 氣相色譜-質譜（GCMS）測定多糖的單糖組成，在密封試管中，100℃TFA水解多糖6h，添加甲醇將水解產物蒸發至干燥，以去除TFA。依次添加去離子水和四氫硼酸鈉（NaBH4）還原單糖3h。還原產物用醋酸酐中和并蒸發至干燥，然后用3mL吡啶和3mL醋酸酐在100℃下乙酰化1h。冷卻至室溫后，旋轉蒸發器去除多余的醋酸酐。乙酰化衍生物通過島津GC-MSQP2010進行分析，色譜柱 HP-5毛細管柱（30.0 m×0.25 mm，0.25μm）。柱烘箱溫度以2℃/min的速率從120℃上升到200℃，并以10℃/min的速率進一步上升到250℃。使用氦氣作為載氣，速率 1.0 mL /min。MS操作參數如下：電離能70eV；離子源溫度230℃；在掃描模式下收集數據。用保留時間和質譜對化合物進行了鑒定。樣品中的糖醛酸還原為中性，隨后通過GC-MS進行測定[10-11]。

4 血清細胞因子水平的測定

小鼠給藥2h后從眼眶采集血樣，血清在4℃下以4000 r/min的速度離心分離10min，然后儲存在-80℃，直到測量細胞因子。根據制造商的方案，使用ELISA試劑盒測定可溶性細胞因子的濃度。

5 抗腫瘤活性

取活的癌細胞（0.2 mL，1×107細胞 /mL）皮下移植到小鼠右側腹股溝。接種后，將荷瘤小鼠隨機分為五組，每組10只，分別為：生理鹽水對照組、環磷酰胺（CTX）50 mg/kg組和以 50、100 和 200 mg/kg濃度給藥的三個三葉青多糖組。每天口服一次生理鹽水和三葉青多糖，連續10d。每隔一天腹腔注射一次CTX。在接種后4、7和10天內測量腫瘤體積。在最后一次給藥后12h，稱量小鼠體重并通過頸椎脫位處死。按照第4所述方法，從眼眶腔采集血樣，以檢測小鼠血清細胞因子。立即收集腫瘤、脾臟和胸腺并稱重[12-13]。通過以下等式計算腫瘤抑制率、脾臟指數和胸腺指數：

抑制率（%）=1-（試驗組平均腫瘤重量/對照組平均腫瘤重量）×100

脾 臟 指 數（mg/g）=脾 臟 重 量 /小 鼠 重 量×1000mg/g

胸腺指數（mg/g）=胸腺重量/小鼠重量×1000（mg）/1（g）

6 脾淋巴細胞增殖試驗

小鼠脾細胞在RPM中的96孔板（1×106個細胞/孔）中培養，并與三葉青多糖在0～400μg/mL下孵育48h。隨后，向每個孔中添加40μLMTS，并將細胞再孵育2h，記錄490nm處的吸光度[14]。

7 THP-1和RAW264.7細胞分泌細胞因子的測定

THP-1和RAW264.7細胞，THP-1細胞用杜爾貝科改良的鷹氏培養基（DMEM）在96孔板（5×104細胞 /孔）培養 48h。然后，制備四種 0、5、10和 20μg/mL濃度的TAK-242，將LPS和三葉青多糖添加到最終濃度為100μg/mL的三葉青多糖中，并將LPS添加到100ng/mL和1μg/mL中。培養24h后，收集培養上清液。將RAW264.7細胞接種到另一個96孔板（1×105細胞/孔）中，重復與THP-1培養相同的程序。使用商業ELISA試劑盒測定細胞因子TNF-α和IP-10的定量。

8 統計分析使用SPSS19.0軟件包進行統計分析。

使用單因素方差分析對數據進行分析。P<0.05的值被認為具有統計學意義。

結 果

1 多糖的分離與表征

250 g三葉青葉子中獲得了27.8gWSP。sevag法脫蛋白后，DEAE-Sepharose陰離子交換色譜進行分離純化。如圖1A所示，在用0.2 mol/LNaCl溶液洗脫的部分中觀察到一個相對較強的峰，該峰被收集用于進一步純化，而用 0.5 mol/L NaCl溶液洗脫的部分呈現一個相對較弱的峰，并被丟棄。隨后在Superdex-200柱上對收集的洗脫液進行色譜分析，并獲得一個單峰，如圖1B所示。收集該組分并命名為三葉青多糖以供進一步分析。

用HPGPC測定三葉青多糖的均一性。如圖1 C所示，三葉青多糖呈對稱窄峰，保留時間為8.325min。右旋糖酐的校準曲線為 lg Mw = 9.9006-0.6184t（R2= 0.9936），（其中 Mw 為分子量，t為保留時間）。根據校準曲線，三葉青多糖的平均分子量約為66.4 kDa，三葉青多糖的總糖和糖醛酸含量分別為84.8%和47.28%。

圖1 多糖的分離和表征

三葉青多糖的FT-IR光譜如圖1D所示。在3398.46 cm-1處觀察到兩種多糖的特征吸收和2945.73cm-1，分別對應于碳水化合物的O-H拉伸和芳香結構和甲基的C-H拉伸。1618.34cm-1處的強吸收表明三葉青多糖中存在羧基。峰值為1745.16 cm-1表明存在糖醛酸。[15]

用BCA蛋白檢測試劑盒測定三葉青多糖蛋白含量為4.48%。此外，經水解和衍生后，用GC-MS測定三葉青多糖的單糖組成，如圖1E的色譜圖b所示。

GC-MS結果表明，還原產物（三葉青多糖R）由Glc、Man、Ara、Gal和 Rha。如圖1E 的色譜圖 c所示。

2 三葉青多糖的抗腫瘤活性

如圖2所示，以H22移植瘤小鼠為研究對象，灌胃給予三葉青多糖，評估其抗腫瘤活性。最后一次給藥后，對照組、CTX組、50mg/kg 三葉青多 糖 組、100mg/kg 三 葉 青 多 糖 組 和 200mg/kg 三葉青多糖組小鼠的體重分別為（36.70g±2.44g）、（34.52g±1.54g）、（33.96g±2.76g）、（34.30g±2.36g）和（34.43g±1.97g）。接種CTX和三葉青多糖后4、7和10天內，用CTX和三葉青多糖治療的小鼠的腫瘤體積小于對照組。在不同的三葉青多糖治療組中，觀察到給予大劑量三葉青多糖的小鼠，在所有組中，CTX治療對腫瘤體積的抑制作用最為顯著。結果表明，三葉青多糖對H22荷瘤小鼠的腫瘤大小和重量均有抑制作用。200mg/kg劑量組對H22腫瘤的抑制率為46.8%，與對照組相比有非常顯著性差異（P<0.01）。根據實驗結果，SYQP通過與對照組表現出顯著差異來抑制腫瘤生長，并且隨著SYQP給藥劑量的增加，抑制率增加。CTX對腫瘤生長的抑制率為66.9%，比SYQP更有效。

圖2 三葉青多糖對腫瘤生長、器官指數和脾細胞增殖的影響。

3 抗脾淋巴細胞增殖

胸腺和脾臟是動物重要的免疫器官，在免疫細胞的產生和免疫反應中起著至關重要的作用。[16]探討三葉青多糖對免疫功能的影響對系統在體、脾臟指數和胸腺指數進行了研究。結果表明，與對照組相比，CTX組胸腺指數和脾臟指數均顯著降低（P<0.01），表明CTX抑制了機體的免疫能力，導致免疫功能減弱。與對照組相比，脾臟和胸腺指數均有改善，且在劑量為200 mg/kg時，與對照組相比有顯著性差異（P<0.01）。這些數據表明，三葉青多糖對H22荷瘤小鼠的免疫器官具有有益作用。

在動物實驗結果的基礎上，進一步研究了三葉青多糖對脾細胞增殖的影響。分離小鼠脾細胞，用三葉青多糖培養。如圖2 所示，0、50、100、200、400μg /mL的三葉青多糖處理顯著刺激脾細胞增殖呈劑量依賴性。類似地，這種治療可以促進有絲分裂原刺激的脾細胞增殖，當應用200μg/mL和400μg/mL的高濃度三葉青多糖時，獲得了顯著差異。因此，本研究獲得的結果表明，三葉青多糖可能同時增強細胞免疫和體液免疫。[17]

多糖精確的抗腫瘤機制相當復雜，多糖發揮抗癌或抗腫瘤活性的一種作用模式可能是激活宿主免疫反應。[18]

胃內注射三葉青多糖的荷瘤小鼠和用三葉青多糖培養的脾細胞的增殖均證明了三葉青多糖在體內外上調免疫系統方面的積極作用，這可能與對腫瘤生長的抑制作用有關。進一步研究三葉清對荷瘤小鼠細胞因子水平的影響，以了解三葉清的作用機制。

4 三葉青多糖對荷瘤小鼠血清細胞因子水平的影響

探討三葉青多糖對血清細胞因子水平的抗腫瘤作用，收集血清樣本，用ELISA方法測定細胞因子。如表1所示，當對照組腫瘤重于1g時，在禁食12h后取出小鼠眼睛并采集血清樣本。盡管正常組與對照組之間幾乎沒有顯著差異，但INF-γ，與對照組相比，服用100和200 mg/kg 三葉青多糖的荷瘤小鼠血清中TNF-α和IL-6水平顯著升高（P<0.05）。

表1 三葉青多糖對荷H22肝癌小鼠血清細胞因子的影響（±s）

表1 三葉青多糖對荷H22肝癌小鼠血清細胞因子的影響（±s）

結果表示為平均值±標準差（n=10），與正常組比較有顯著性差異，*P<0.05；與正常組比較有非常顯著性差異，**P<0.01；與對照組比較有顯著性差異，△P<0.05；與對照組比較有非常顯著性差異，△△P<0.01。

Group Dose（mg/kg） TNF-α（ng/L） IL-6（pg/mL） IFN-γ（ng/L） IL-1β（ng/L）Normal - 377.07±23.10 21.79±4.19 34.88±7.44 15.68±2.01 Control - 332.40±27.59** 16.81±4.81 36.29±8.73 14.66±1.56三葉青多糖 50 355.07±37.21 21.32±4.82 48.75±12.38 12.97±1.56三葉青多糖 100 371.07±24.83△ 23.65±5.59△ 53.64±11.89*△ 14.83±2.56三葉青多糖 200 395.07±20.49△△ 26.11±6.32△△ 71.98±17.99**△△ 17.52±5.23

此外，三葉青多糖處理濃度為10、100和1000μg/mL對H22肝癌細胞系的體外生長無明顯影響。結果表明，三葉青多糖的抗腫瘤活性不是通過直接殺死腫瘤細胞來實現的，但與其免疫調節活性有關[19]。服用三葉清多糖可激活免疫功能，包括巨噬細胞、T或B淋巴細胞和自然殺傷細胞，并促進細胞因子的產生，以促進免疫系統的調節[20]，表明，三葉青多糖中存在高含量的GalA，因此，GalA除了其他成分外，可能在抗腫瘤和調節免疫調節活性方面發揮重要作用。GalA的生物活性和藥理學有待進一步研究。

5 三葉青多糖與toll樣受體4（TLR4）的結合激活免疫調節因子

如圖3所示，研究發現，100μg/mL的三葉青多糖和1μg/mL和100 ng/mL的LPS都能刺激THP-1分 泌 TNF-α 和 IP-10，TAK-242阻 斷 TLR4后，TNF-α和IP-10被顯著抑制。在RAW264.7中也觀察到同樣的現象。表示三葉青多糖可以通過MyD88依賴和三重依賴途徑刺激TLR4，這可能與LPS的機制相同。

圖3 三葉青多糖對TAK-242抑制劑處理的THP-1細胞因子分泌的影響

討 論

本研究比較了三葉青地上部分的水溶性多糖，發現在200 mg/kg 三葉青多糖小鼠模型中，對H22腫瘤的抑制率為48.6%。脾臟指數、胸腺指數和脾細胞增殖與三葉青多糖的應用成正比，表明多糖激活了免疫功能。添加TLR4抑制劑TAK 242后，三葉青多糖和LPS刺激產生的細胞因子（包括IP-10和TNF-α）減少，表明三葉青多糖和LPS都通過TLR4刺激細胞因子的產生。進一步的研究表明，服用三葉青多糖可以刺激細胞因子的產生，降低LPS引起的血清細胞因子水平，這表明三葉青多糖可能與TLR4競爭，與TLR4相互作用，調節細胞因子的產生。因此，結果表明，三葉青多糖的抗腫瘤活性不是通過腫瘤細胞的凋亡來實現的，而是通過其多糖的免疫調節活性來實現的。本研究將為開發三葉青多糖作為腫瘤藥物提供基礎。