豬性控精液技術應用研究的進展

宋宇倫，馮赫澤，周彥芝，李 遠，魏國生 ，李井春

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319）

我國是人口大國，也是肉制品消耗大國，據了解，近10年我國人均肉制品年消耗量從30多千克增至60多千克，為了解決畜牧業畜禽數量、產量等的實際問題，利用性別控制技術促進畜牧業的發展尤為必要。性別控制技術是一項現代生物技術，通過人為參與選擇分離X、Y精子，最終得到所需性別的后代，具有非常重要的理論與現實意義。首先，性別控制技術能夠充分發揮公畜生長速度、肉質性能，母畜的繁殖、泌乳性能，從而獲得巨大的經濟效益；其次，能夠增強優良性狀強度，加快育種進程，降低育種成本，以獲得最大的遺傳進展；此外，還可以通過控制后代的性別克服孿生不育等現象，并排除伴性有害基因的危害等問題。性控精液能夠通過分離冷凍的精液選擇性別進行輸精，最終達到生產所需的目的，因此，高效準確的分離性控精液成為性別控制技術的重點研究方向之一，在畜牧生產中，性控技術的研究具有非常重要的實際生產價值。

目前，國內外的科研人員針對于性控精液分離的方法及胚胎性別鑒定進行了大量的研究，其中主要集中在以下幾種方法。

1 Percoll密度梯度離心法

Percoll密度梯度離心法是指在離心過程中，由于X、Y精子在分離介質中的沉降速度不同，導致所處密度梯度不同，經過一段時間后最終分離精子的方法。S Kaneko等使用Percoll 密度梯度離心分離人X、Y精子時，正常精子和少精癥精子中含有Y精子的比例分別為46.7%和46.6%，且分離后精子仍具有活力。曹世禎等研究表明，利用Percoll不連續密度梯度分離奶牛定性精液，所獲精液的后代性別比例差異顯著，其中富含X精子的定性精液后代雌性占比均在60%以上。Percoll密度梯度離心技術操作簡單，成本低，但在離心過程中，精子細胞容易產生高濃度的活性氧（ROS），損害精子活力，降低精子完整性。

2 流式細胞儀分離法

流式細胞儀分離精子是根據X、Y精子之間的DNA含量差異進行分離。在分離X、Y精子時，常用的熒光染色劑為Hoechst33342，經過染色的精子會發光的為活精子，由于X精子的DNA含量高，結合的染色劑多，因此發光強度高于Y精子，導致激光系統被激活，使熒光信號轉化成電信號，從而對兩種不同的精子附上不同的正負電荷，最終落入不同的收集管中完成分離。宋林等利用流式細胞儀分離奶牛精子受胎后，對性別比例的影響較大，但分離解凍后的精子活力較原精活力低。熊顯榮等在使用流式細胞儀的基礎上添加誘惑紅，使質膜不完整的精子著色淘汰，能顯著增強分選后牦牛精子的活力，在一定程度上能夠提高性控凍精的受胎率。但增有權等在使用流式細胞儀分離豬精子進行受胎后，輸Y精子產仔率100%，輸X精子產仔雌性率為91.67%，但窩產仔數呈下降趨勢。流式細胞儀分離X、Y精子是目前在實際生產中被大規模應用的分離技術，但在分離豬精液方研究用較少，未來還需對分離豬精液開展進一步研究。

3 免疫法分離X、Y精子

Toll樣受體（Toll-like receptors,TLR）是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質分子，能夠識別特定的病原體，在哺乳動物精子中表達，并通過干擾精子獲能和過度激活精子活力來損害精子受精。目前已經發現的TLRs家族成員有11個，其中TLR7/8只在X染色體上表達。Umehara等研究表明，X染色體編碼的TLR7/8在X精子中部和尾部表達，而在Y精子中不表達。Umehara等進一步將TLR7/8用于分離小鼠精子，在添加R848配體的條件下，小鼠的X、Y精子活力差異顯著，溶液中顯示分層狀態，X精子的活力受到抑制，處于下層，當清除R848后，X精子活力被恢復，且仍然具備受精能力。Fa Ren等在奶山羊分離X、Y精子中使用TLR7/8受體時得到同樣的結果，并且證明TLR7/8能夠直接調節奶山羊的ATP水平來影響X精子活力。劉偉東研究表明，在肉牛精子中TLR7/8激動劑R848能夠顯著降低X精子的運動性能，但對精子頂體完整性和質膜完整性沒有明顯影響，且利用R848對肉牛鮮精進行分選，分選后Y精子純度可以達到88.6%，X精子純度可以達到72.5%。TRL7/8分選精子雖然準確率不高，但操作簡單方便，試驗過程中不損傷精子，不需要昂貴的設備，節省生產成本。目前在分離牛、羊、小鼠中已經展開相關研究，但在分離豬精子的研究中還處于空白狀態，在今后的研究中具有很大的發展潛力。

4 PCR法鑒定胚胎性別

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外擴增技術。在進行胚胎性別鑒定時，通常選擇Y染色體上的性別特異基因（如SRY基因）進行擴增，根據是否可以擴增特異基因來判斷胚胎性別。目前胚胎鑒定的PCR法主要有常規PCR、巢式PCR、雙重和多重PCR。孫俊麗等利用巢式PCR技術，對豬X和Y染色體上牙釉質基因（Amelogenin gene，AMEL）進行胚胎性別鑒定，試驗結果顯示，經PCR產物片段掃描后雌性胚胎只有一個峰值，雄性胚胎有兩個峰值。尹智等利用SRY和zfy/x基因的特性，采取雙重PCR技術對6只30 d左右的豬胚胎的性別進行鑒定，結果顯示SRY序列擴增后，一個樣品出現兩個擴增帶為雄性，剩余無特異擴增帶為雌性。李小平等根據豬的SRY基因和GAPDH基因序列合成兩對引物，通過雙溫多重PCR技術對豬進行早期胚胎性別鑒定，結果顯示只能擴增GAPDH基因片段的為母豬，對SRY基因片段和GAPDH基因片段都能夠擴增的為公豬，且試驗中減少一步程序，可進一步縮短試驗時間，減少精子損傷。

5 展望

性別控制技術對畜牧業的發展有著重要意義。當前性別控制技術正在逐步完善，許多存在的問題都已被解決，但仍有部分技術難題一直存在，如損傷精子、分離時間長等，阻礙畜牧業的發展。流式細胞儀在性別控制技術中被廣泛應用，但對于豬性控精液的發展和應用還不成熟。利用TLR7/8在X、Y精子中的蛋白表達差異進行精子分離的試驗中取得了較好的成績，可望在日后的研究及生產中得到更多的運用。目前對于豬性控精液的研究與應用，相較于牛羊等產業還處于落后狀態，但隨著科技的進步和新技術的發掘，相信一定能夠填補空缺，促進畜牧業更好的發展。