八寶景天總黃酮的提取純化及抗氧化抑菌活性的研究進展

鄭樂樂，錢義慧，馬麗君，張雙雙，李 娜

（宿州學院生物與食品工程學院，安徽 宿州 234000）

八寶景天（Hylotelephium erythrostictum），別名蝎子草、長藥景天、華麗景天，是一種可以為藥用的、名為八寶的草藥。又名“八寶”“胡豆七”“活血三七”等，屬于景天科八寶屬的草本植物，其葉子肥大，根莖粗壯，根莖、葉子及花朵都可以入藥，并且一年四季都可以隨時采摘，但更多的人喜歡用新鮮的八寶景天來入藥。八寶景天在《海藥本草》 《開寶本草》 《本草綱目》等中醫學典籍中均有記載，在東北、河北、湖北、江蘇、浙江、安徽、河南、四川、貴州、云南、山西等地都有大量栽種，而且生長狀況良好，是一種極易栽培、生長范圍很廣的植物。八寶景天無論在生物學上還是在化學上，其性質均很穩定、口感較為苦澀，并帶有略微的酸味。此外，八寶景天還有清熱解毒、祛風除濕、促進皮膚血液循環、止痛止血的作用。經過對八寶景天深入研究，發現其及其提取物中含有非常復雜、豐富且多元化的生物功能性物質，其中包括各種天然活性生物堿、甾體、鞣質、黃酮類化合物及其衍生物、縮合單寧和生氰化合物等，使得黃酮類化合物在醫療應用方面的成效非常顯著。

黃酮類化合物（Flavonoids 或flavonoes compounds） 是指基本母核為2- 苯基色原酮的類化合物，具有一個由中間的吡喃或吡喃酮環（C） 連接的2 個苯環（A 和B） 的三環核心，是一大類的次生代謝產物，在長期的自然選擇過程中所形成，在植物群落中有大量的存在。目前，已經研究發現了近萬種植物中含有類黃酮類成分，并且類黃酮的種類已經超過了5 000 種，其中最為常見的是：二氫黃酮及二氫黃酮醇類、異黃酮和黃酮醇類、黃烷醇類、花色素類、雙黃酮類、查耳酮類及其他黃酮類。雖然大多數的類黃酮都可以與糖基化合成糖苷，但是也有一些是以游離狀態存在。黃酮類化合物的藥理作用多種多樣，已被大量的試驗研究證實，其藥理作用有抗氧化、消炎、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗癌、抗衰老、抗抑郁、抗心腦血管疾病、抗糖尿病及其并發癥、調血脂及提高免疫力等。

八寶景天作為一種觀賞性植物，在園林綠化中得到了廣泛的應用，然而關于八寶景天更高的藥用價值，特別是其黃酮類物質的有效提取、分離、純化及其抗氧化、抑菌作用的深入研究寥寥無幾?，F綜述八寶景天總黃酮的提取工藝、總黃酮經大孔樹脂純化的最優分離條件，以及八寶景天總黃酮的抗氧化、抑菌作用的生物活性。

1 總黃酮的提取

1.1 超聲提取法

超聲波萃取是一種有效成分的提取方法，在中藥活性成分的提取中被廣泛應用。超聲提取技術是將高能超聲注入到提取體系中，使體系內形成無數個小孔并快速閉合，當小孔閉合時，將會產生瞬間高壓，推動超聲提取加快提取速度。通過介質吸收超聲波并產生內摩擦，使其產生強烈的振動，通過這個過程，使超聲振動的機械能轉化為介質內能。同時，介質的溫度和植物天然產物組織的內部溫度也會逐步升高，導致2 種壓力均可引起試樣表面的變形和破壞。此外，溶劑和樣品粒子之間存在不同的加速度，二者之間產生的摩擦會導致2 個碳原子之間的碳碳雙鍵發生斷裂，導致聚合物的裂解。超聲提取對象物質的方法主要有3 種機理，即熱空化學作用、熱作用和機械作用，這3 種機理被廣泛應用于超聲提取技術中。將超聲波萃取技術應用于植物活性成分的提取過程中，不僅能節省能源，還能有效地提高提取效果。

1.2 酶解法

一些特定的酶類可以在一定程度上促進某些特定的化學反應，使其具有較高的反應效率和較高的產物活性。酶解法是將蛋白質的肽鍵或胺鍵進行特定的水解，蛋白質經酶解后，其極性基團數目增加，肽鏈長度變短，肽鏈相對分子質量下降，使蛋白質的溶解性增強，功能形狀也會隨之變化，細胞壁或者蛋白質與多糖的結合物被破壞，目標產物——總黃酮類化合物被釋放。由于植物細胞壁主要由一種可溶于水的纖維素構成，且含有少量的果膠，因此在大量的試驗中，人們常采用木質素（Lignose） 抑制劑或多聚果膠酶（Polypectinase） 抑制劑，將細胞壁組分直接氧化降解，以獲得細胞膜包裹的胞漿系統物質。破壁后，對提取活性物質和有機溶劑的萃取具有極大的促進作用。

1.3 酶法輔助超聲提取

通常用于試驗研究的萃取法，其具有簡便、快速和安全等特點，然而任何方法都具有兩面性，該方法存在提取時間長，提取效率低等問題。針對這一問題，擬以八寶景天為對象，利用適宜的酶和適宜的超聲能量，在有機溶劑中高效提取其有效成分。利用響應曲面（Box-behnken） 法建立酶輔助超聲波的優化模型，確定酶輔助超聲波的最優條件，實現快速、溫和的提取。在Box-behnken 模型中，能夠更清楚地看到每個因素對反應值的影響，為八寶景天中總黃酮的深層次開發利用提供參考。

呂凱波等人[1]在前期的研究中，發現酶輔助超聲波法的最佳條件為超聲功率100 W，料液比1∶17（g∶mL），超聲處理時間32 min，纖維素酶添加量約為2.6%，超聲酶解持續時間49 min，試驗證明，該方法提取的總黃酮含量可達14.01%，該方法提取的活性成分具有（89.9±0.06） %的抗·OH 能力，研究發現，與水煎法、回流法、酶法、超聲波法等相比較，酶輔助超聲波法在提取液中的活性成分含量要高出10%以上，超聲波與酶法結合提取的活性物質表現出了較好的抗氧化性，該活性物質的DPPH·、·OH 清除率都可提高20%以上。唐文文等人[2]利用超聲波乳化結合雙酶（纖維素酶、果膠酶） 快速高效地提取了當歸表層部位中的總黃酮，最佳的提取工藝為酒精體積分數小于50%，料液比大于50∶1，超聲波提取時間大于41 min，雙酶量地濃度比（纖維素酶∶果膠酶= 2∶1） ＞0.68 g/L，酶的完全水解所需地超聲波時間大約是93 min，在以上5 個最基本的水解條件下，從當歸地表部位中提取的總黃酮的提取率達到了8.18%。孟永海等人[3]利用單因素試驗，對乙醇萃取主要藥物所使用酶的含量百分數及主要藥物用量、乙醇體積分數、溶液pH 值、料液分配體積比、萃取溫度及時間、超聲溫度、時間及功率等進行了研究，并對萃取方法的影響進行了探討；以上述結果為依據，應用響應面法對酶法輔助超聲法提取刺玫果實中總黃酮的工藝進行了優化，最終得到了總黃銅的最佳提取方案為纖維素酶用量15 mg/g，乙醇體積分數60%，溶液pH 值5，藥物∶乙醇= 1∶15（g∶mL），提取溫度50 ℃，提取時間2.0 h，超聲提取輔助加熱功率為450 W，超聲溫度50 ℃，超聲時間40 min，刺玫果實提取物中的總黃酮提取率為128.6 mg/g。

2 黃酮類化合物的分離純化

采用酶輔助超聲波萃取的粗提物，其組分非常復雜，可能會影響后續八寶景天總黃酮的抗氧化、抑菌活性研究。另外，粗提物中總黃酮的相對含量偏低，不能滿足后續試驗的要求。因此，需對粗提物進行提純處理。為了得到較高的純度，在分離純化過程中，一般都會使用大孔樹脂吸附的方法以得到更高純度的提取液。

大孔樹脂吸附法與其他吸附法相比，大孔樹脂的吸附提純能夠在每單位質量的物質上提供更大的總面積（比表面積），并具有更大的吸附容量、更好的選擇性、更快的吸附速度等諸多優點。大孔吸附樹脂是一類具有高選擇性、高穩定性的固體分離材料。大孔樹脂特殊的三維立體多級孔結構，增大了分粗提取液與大孔吸附樹脂之間的接觸面積，使其具有更大的范德華引力，并可形成更多的氫鍵作用，這樣可以將來自極低濃度溶液的目標有機物質進行吸附。由于大孔樹脂在3D 空間中具有不同尺寸的立構孔道，使其在溶液流經大孔樹脂時，不同分子在孔道中的穿透力存在較大差異，進而影響其對溶液的吸附速度。在利用大孔樹脂對粗提取液純化的過程中，可以將具有不同吸附力和不同分子量尺寸的有機化合物吸附在樹脂上，然后用不同的溶劑洗脫，從而實現精細的分離和提純[18]。

2.1 大孔樹脂的分類及常見型號

將大孔樹脂按照其極性大小及所選擇的小分子與分子間以共價鍵結合形成聚合物的小分子結構的區別，將其劃分為三大類：非極性大孔吸附樹脂、極性大孔吸附樹脂，以及中極性大孔吸附樹脂[19]。大孔樹脂的種類繁多，而且每一種樹脂的型號都不一樣，不同類型和型號的大孔樹脂，其吸附特性也會有很大的差異。目前，我國有南開大學化學研究所生產的AB、D、H 系列，上海制藥研究所生產的SIP系列等。

2.1.1 非極性大孔樹脂

非極性大孔吸附樹脂又被稱為芳香性吸附劑，如苯乙烯，二乙烯苯等，有很小的轉矩用來收集單倍體。由于其主鏈結構中不含有任何功能性堿基，因此非極性大孔樹脂表面具有較強的疏水性，但對有機溶劑中的疏水性組分具有較強的吸附能力。最適宜的是在極性溶劑中對非極性物質（如水） 進行吸附，而在極性溶劑中對小分子的疏水性部分則會產生分子作用。在實驗室中常用的模型有XAD-1600，D-101，D3520，HP-20，CAD-40 等[20]。

2.1.2 中等極性大孔樹脂

中極性大孔樹脂是以多官能團的甲基丙烯酸酯作為交聯劑的一種含有酯基的大孔樹脂，將其包裹在含醚基的整體中，并與多孔層相結合，其表面包括排水和剖面兩部分。中性多孔吸附樹脂可以從極性溶液中吸收非極性物質，也可以將非極性溶液中的大多數極性物質吸出，還可以將其作為脂族吸附劑，如聚丙烯酸酯類聚合物。中極性大孔樹脂在工業上有著廣闊的應用前景。試驗中較常用的大孔樹脂類型有LX-28，ADS-45，BS-45，BS-45，BS-45，BS-45，BS-75 等[21]。

2.1.3 極性大孔樹脂

極性大孔樹脂（Polymer porous gap resin） 主要由含有酰胺基、氰基、酚羥基的樹脂組成，其中有的樹脂還可利用靜電作用對極性物質進行吸附，如丙烯酰胺。XAD-10、XAD-11、AD-12、NAK-9、DouliteXAD-761 等[19]都屬于極性大孔樹脂。

2.2 大孔吸附樹脂在總黃酮純化中的應用

侯夢陽等人[7]采用比較試驗對NKA-9、HPD100、HPD400、HPD600、AB-8、D101、X-5、DM301 等型號的大孔吸附樹脂的制備及其對玳玳花總黃酮的吸附、解析力進行了測定，得出AB-8 型的提純效果最好；楊永濤[8]以3 個主要的孔解吸附速率樹脂為主要原料，通過對6 中樹脂（AB-8、D101、S-8、X-5、HPD-500NKA-9） 的吸附速率的比較，從羅布麻中篩選出高效的HPD-500 樹脂。荊常亮[9]的研究表明AB-8 型大孔樹脂是從草本植物中提取和提純總黃酮的最好方法，其純度可達79.62%。鄧夢琴[10]用NKA 型大孔樹脂對菠蘿蜜中的總黃酮進行富集純化，其總黃酮含量從16.74%上升到了84.42%。敬思群[11]使用AB-8 型大孔樹脂對昆侖雪菊中的總黃酮進行了分離純化，結果表明，總黃酮含量由28.12%增加到52.43%，增加了86.5%。王雯[12]用D-312 型大孔樹脂對化橘紅中總黃酮進行了分離純化，結果表明化橘紅中總黃酮的含量從14.16%上升至53.5%，在此基礎上優化了上樣溶液pH 值為4、吸附流速1.0 mL/min 的洗脫條件下，pH 值為7，洗脫流速為1.0 mL/min，洗脫溶液體積含量為80%。庫詠峰[13]通過對9 種不同型號大孔樹脂的靜態吸附以及動態吸附的比較，發現HPD-500 型大孔樹脂的吸附性能比其他類型大孔樹脂更好，能夠使肉桂中總黃酮的提取率達到91.81%。林志欽[14]使用X-5 型大孔樹脂，對蓮子芯中的總黃酮化合物進行了分離與純化，并確定了其最佳提純工藝：上樣質量濃度5.1 mg/mL，上樣pH 值6，上樣流速為物料的2 倍體積每小時，上樣量為物料的2 倍體積，洗脫劑體積分數為50%的乙醇，洗脫流速為物料的2 倍體積每小時，洗脫劑用量為4 倍體積。

3 總黃酮的生物活性

3.1 抗氧化活性

黃酮類物質具有與其他抗氧化劑相似的抗氧化機制，其主要機制是產生氧原子，然后氧化生成多酚自由基。其氧化產物相對穩定，不容易被其他大分子所破壞，且具有良好的金屬絡合作用。這類化合物具有高度的離域性質、完備的的大π 鍵共軛體系，強配體和適宜的立體結構等特點，是一類非常理想的金屬離子配體。已有的研究表明，類黃酮金屬絡合物可顯著提高材料的抗氧化性。黃酮不但能抑制脂肪氧酶和NADH 氧化酶等酶的活力，起到抗氧化效果，還能使黃酮類化合物的抗氧化性能得到全面提高。梁證等人[22]采用AB-8 型大孔樹脂提純了仙人掌的果皮和果肉中的總黃酮，證明了仙人掌的抗氧化性。楊永濤[23]對羅布麻中總黃酮的大孔樹脂純化物產物的抗氧化性進行了研究，結果顯示，大孔樹脂純化產物對DPPH·，·OH，O2-·，ABTS+·等都有一定的清除作用，其抗氧化性比總黃酮粗提物強。吳婕等人[24]研究結果顯示，在甜茶葉中總黃酮的質量濃度相同的情況下，經提純后的總黃酮對ABTS+自由基的清除率降低了28.6%，結果表明，經大孔樹脂純化后的甜茶葉總黃酮具有更強的抗氧化能力。王寒冬[25]研究發現，DM130 型大孔樹脂對趕黃草黃酮具有較強的DPPH 自由基清除能力，并具有較強的還原能力。

3.2 抑菌活性

杜銀香等人[26]采用大孔樹脂法從華中枸骨葉中分離得到了一種有效成分，初步證明該成分具有一定的體外抗菌活性，且隨著該成分的含量的增加，其抗菌活性也隨之增強。賴譜富等人[27]在研究過程中，采用大孔樹脂分離純化了多年生藤本豆的總黃酮，結果表明，多年生藤本豆的總黃酮抗菌活性隨其濃度的增大而增大。孫丹丹[28]在試驗中發現，凍綠葉黃酮溶液種類相同的情況下，不同濃度的凍綠葉黃酮溶液的抑菌效果有明顯差異。龍旭等人[29]研究表明，丹參總黃酮對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌均有較強的抑菌效果，且對革蘭氏菌也有較強的抑菌效果，但在相同濃度丹參總黃酮的條件下，其抑菌效果具有明顯的大小差異：大腸桿菌＞金葡菌＞綠膿桿菌，說明丹參總黃酮對細菌有較好的抑制作用。劉芮等人[30]在前期工作中發現，銀杏黃酮提取物可延長3 種致病菌（金葡菌、大腸桿菌和丙二酸鹽克羅諾桿菌） 的感染延遲期，銀杏黃酮作用8 h 后，3 種致病菌細胞破裂，內容物泄露；3 種致病菌在銀杏黃酮提取物處理4～12 h 后，其3 種致病菌菌液中的AKP 酶活性明顯升高；銀杏黃酮可是病原菌細胞內活性氧（ROS） 升高，表明其可能是病原菌細胞形態發生改變，使其失去存活能力。邵方宣[31]的研究表明，北橐吾總黃酮溶液在處理3 h后，能夠與Ecolid 的細胞成分相結合，破壞其細胞壁及細胞膜的完整性，引起Ecoli 細胞形態的顯著改變。另外，北橐吾總黃酮還能改變Ecoli 細胞膜的滲透性，嚴重時會將Ecoli 細胞膜徹底破壞，造成Na+、K+、DNA 等物質的大量外流，試驗總結了黃酮類化合物的抗菌活性，黃酮類化合物能夠通過干擾細菌體內DNA 的作用，影響體內的氧化還原反應的平衡狀態，甚至會破壞目標菌的細胞膜，改變細胞膜的通透性及細胞中ROS 含量等，從而起到抑菌的效果。

4 結語

擬利用Box-behnken 試驗設計，通過雙酶輔助超聲波的方法，以八寶景天中總黃酮類化合物為研究對象，在降低其他因素干擾的同時，得到最佳的提取工藝，并極大地提高了總黃酮成分的提取率。通過對大孔樹脂吸附、分離和提純工藝的研究，不僅可以提高總黃酮的純度，還能夠去除粗提物中的雜質，也能增強總黃酮的生物活性。近年來，隨著總黃酮化合物的提取和分離，以及對總黃酮化合物抗氧化和抑菌作用的研究，得到了廣泛的關注和深入，對八寶景天總黃酮的提取方法、大孔樹脂的純化方法及經純化后的總黃酮抗氧化和抑菌活性進行了綜述，以期為今后八寶景天總黃酮化合物的開發和利用提供一定的參考。