Drp1介導線粒體能量代謝拮抗大鼠缺血再灌注腎損傷

陳思奇 彭榮東 徐嘉琪 馮俊霞 周曉瑩 張云芳,4 蘇妍妍

1南方醫科大學附屬花都醫院 廣州市花都區人民醫院腎病學科，廣州 510800；2廣州市花都區清布社區衛生服務中心綜合科，廣州 510800；3南方醫科大學附屬花都醫院 廣州市花都區人民醫院腎病實驗室，廣州 510800；4南方醫科大學第三臨床學院，廣州 510515

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）嚴重危害人類健康，由其引起的高病死率和嚴重并發癥越來越受到關注［1］。AKI 發病機制復雜，缺血再灌注、氧化應激、炎癥、血管收縮和細胞凋亡等多種病理因素參與AKI的發生、發展，腎缺血再灌注被認為是AKI 發展的重要原因之一［2-3］。本課題組前期研究發現，阿托伐他汀、黃芪、全反式維甲酸等藥物對腎臟缺血再灌注損傷有保護作用，但具體的分子機制仍有待進一步闡明［4-7］。腎臟是機體排泄代謝廢物、重吸收營養物質、維持水、電解質和酸堿平衡的重要器官，其功能的維持依賴于組織細胞線粒體提供的能量。由線粒體分裂、融合和線粒體自噬組成的線粒體動力學穩態是維持線粒體正常功能的重要保障，線粒體穩態受損會引起線粒體功能障礙，導致ATP 生成減少，進而引起細胞正常結構和功能喪失［8］。例如，在AKI 和糖尿病腎病中存在持續性的線粒體功能障礙，因此線粒體功能障礙被認為是AKI 啟動和發展的重要原因［9-10］。線粒體分裂異常是引起線粒體功能障礙的一個重要因素，正常的線粒體分裂有賴于線粒體動力相關蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）和線粒體分裂因子（mitochondrial fission factor，Mff）這2種蛋白的參與［8］。本課題組先前研究結果顯示，Drp1 通過磷酸化促進其從細胞質向線粒體表面轉位，激活并促使線粒體分裂及碎片化，促進缺血再灌注腎損傷［11］。基于此，本研究進一步探討選擇性抑制Drp1 蛋白是否參與線粒體能量代謝，并改善缺血再灌注誘導的AKI。

材料與方法

1.材料

1.1.實驗動物 雄性Wistar 大鼠20 只，8～10 周齡，體質量0.25～0.30 kg，購自中山大學（實驗動物中心東校園），實驗動物許可證號：scxk（粵）2016-0029。飼養于SPF級，溫度（72±3）℉和空氣（50±20）%相對濕度控制的動物房中，按照12 h光照/黑暗循環，并給予標準飲食和飲水。

1.2.儀器與試劑 超凈工作臺（蘇州凈化設備公司）；5840R 低溫高速離心機（德國eppendorf）；5200 凝膠成像系統（Tanon）；IX53 正置顯微鏡（日本奧林巴斯）；血肌酐酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（晶美公司，JM-10435R1）；ATP 酶檢測試劑盒（南京建成，A016-1）；兔抗大鼠Drp1（英國Abcam 公司，ab184247）；線粒體提取試劑盒（Solarbio 公司，SM0020）；流式細胞檢測儀（美國BD 公司，FACSCalibur）；全波長酶標儀（Multiskan GO，美國賽默飛）。

2.1.大鼠缺血再灌注腎損傷模型的建立、分組及給藥 8～10 周齡雄性Wistar 大鼠隨機分為4 組，分別為正常對照組、假手術組、模型組和Drp1 抑制劑組，每組5 只。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（Sigma-Aldrich，P3761）（50 mg/kg 體質量）進行麻醉，平躺固定后，切開皮膚并逐層分離打開腹腔，切除右腎，暴露左腎動脈后，利用動脈夾夾閉，血液逐漸變暗紅，60 min 后松開恢復腎臟血流灌注，觀察腎臟由暗紅變為鮮紅，表明再灌注成功。Drp1抑制劑組中，參考文獻［12］給 藥 劑 量 ，夾 閉 腎 動 脈 前 2 h 腹 腔 注 射Mdivi-1（MedChemExpress，CS-2462）（20 mg/kg 體質量），隨后夾閉左腎動脈60 min 后松開恢復腎臟血流灌注，而模型組的大鼠夾閉腎動脈前用生理鹽水腹腔注射作為對照；假手術組大鼠行同樣開腹操作，但不夾閉腎動脈。關腹待大鼠腎臟再灌注24 h 后，處死大鼠并留取腎臟組織標本和血清標本。正常組大鼠不做處理。

2.2.鼠腎臟功能及組織學評估 采取鼠尾刺血法對大鼠尾靜脈取血，離心有效半徑15 cm，3 000 r/min，10 min離心獲得血清，ELISA 測定血清肌酐水平來反映各組大鼠腎功能。蘇木精-伊紅（HE）染色用于大鼠腎臟組織學評估，即在大鼠麻醉后處死留取0.2 μm 厚腎臟組織依次用4%多聚甲醛（廣州化學試劑廠，20150101-1）固定，脫水后石蠟包埋，切成0.3 μm 切片，二甲苯脫蠟2 次（10 min/次）；依次用100%、95%、85%、70%梯度乙醇和去離子水去除二甲苯及覆水，每步浸泡5 min，接著用蘇木素和伊紅染色，然后用70%、85%、95%、100%乙醇和二甲苯進行脫水通透，通風柜中晾干，隨后中性樹膠封片，最后顯微鏡下觀察。對腎組織的腎小管損傷情況采用Paller 法評分法評估，每個腎臟HE 染色片子高倍鏡下隨機選擇10個視野，按以下標準評分：腎小管明顯擴張、細胞扁平1分；刷狀緣損傷1分；刷狀緣脫落2分；腎小管管型2分；腎小管官腔有脫落、壞死細胞，未成管型1分。

2.3.DNA 斷裂原位末端標記法（TUNEL 法）檢測細胞凋亡 大鼠腎臟組織石蠟切片，按常規方法進行脫蠟步驟。依據TUNEL 凋亡檢測試劑盒（ABP，A050-50T）說明書的實驗步驟進行染色。隨機選取高倍鏡下10個視野，統計被染成綠色細胞的總數，結果表示為凋亡細胞數/HPF（放大200倍）。

2.4.腎組織細胞線粒體形態學檢測 取大鼠新鮮腎組織切成<1 mm 薄片，利用透射電鏡觀察腎小管上皮細胞中線粒體形態學變化。留取新鮮腎組織薄片后用2.5%的戊二醛溶液4 ℃過夜固定，包括部分腎皮質和髓質，經過脫水、包埋、固化、切片和3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后，利用JEM-2100F 透射電子顯微鏡（日本電子株式會社，JEM-1400PLUS）觀察拍照。

2.5.腎組織細胞線粒體ATP 酶活力測定 取大鼠少許新鮮腎組織置于冰上勻漿器內，加入1 ml 預冷裂解液并將組織研磨成勻漿，依據線粒體提取試劑盒操作步驟經多次離心后取得線粒體懸液，BCA 法計算線粒體蛋白含量。按照ATP 酶活性檢測試劑盒步驟處理樣本，并在酶標儀上檢測標準磷和待測樣本在660 nm 的OD 值，校正待測樣本背景后進行計算Na+-K+-ATP 酶活力。組織線粒體中ATP 酶活力計算公式：組織中ATP 酶活力（U/mg prot）=（測定OD值-對照OD 值）/（標準OD 值）×標準品濃度×樣本測試前稀釋倍數×6/待測樣本蛋白濃度。

2.6.細胞培養處理和線粒體膜電位檢測 HK-2 細胞（Chinese Academy of Sciences）培養于37 ℃，5% CO2的細胞培養箱中，利用含有10% FBS 的DMEM/F12（Hyclone，SH30023.01）培養和接種，培養至匯合率90%后，按照5 ×105細胞/孔數量接種于6 孔板中，過夜待細胞充分貼壁。正常組細胞在完全培養液中培養，不作其他改變；對照組細胞在基礎培養基中培養24 h，隨后在完全培養基中繼續培養2 h，其他條件不作改變；Drp1 抑制劑組細胞在缺氧之前在含有5 μM Mdivi-1 的基礎培養基中預處理2 h，隨后Drp1 抑制劑組和模型組細胞分別更換成基礎培養基后，置于1% O2、5% CO2、94% N2的低氧培養箱中培養24 h，然后更換成完全培養基中并轉移到正常培養箱中繼續培養2 h；細胞經上述處理后，用PBS 洗滌2 次，胰酶消化后形成細胞懸液，按照線粒體膜電位檢測試劑盒步驟進行JC-1 染色，隨后在流式細胞儀上進行分析。

3.統計學分析

對照組采用0.7mm×19mm蝶翼針頭穿刺，直接至患者床旁工作，抽有造影劑高壓注射器（美國數控注射器，型號：MEDRADENVISON CTTM）上連接蝶翼針，排盡注射器內空氣實施常規靜脈穿刺即可。研究組采用24Gx0.75靜脈留置針（生產企業：蘇州碧迪醫療器械有限公司）穿刺，首先穿刺前盡量選擇粗直靜脈血管，同時穿刺部位上方需加止血袋，常規局部消毒，保持15～30°角逐步穿刺至患者血管，見回血將套管逐步進入血管內部，針頭固定且將針芯抽出，最后適量注入生理鹽水即可[1]。

采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，計量資料符合正態分布，以（±s）表示，多組間比較用方差分析，以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.抑制Drp1降低缺血再灌注大鼠血肌酐（圖1）

圖1 抑制Drp1降低缺血再灌注大鼠血肌酐

模型組血肌酐水平［（48.68±2.065）μmol/L］明顯高于正常對照組［（36.26±4.124）μmol/L］和假手術組［（41.12±1.895）μmol/L］（P<0.05），這表示大鼠腎臟缺血再灌注造模成功；Drp1 抑制劑組血肌酐水平［（43.28±0.895）μmol/L］低于模型組［（48.68±2.065）μmol/L］（P<0.05）。

2.各組大鼠腎組織病理學觀察（圖2）

圖2 Drp1抑制劑改善缺血再灌注大鼠病理損傷。A為HE染色檢測大鼠腎臟組織病理變化；B為Paller評分法評價腎臟損傷得分情況

光鏡下可見模型組大鼠腎小管上皮細胞變性、壞死，刷狀緣脫落，管型形成，組織間質炎癥細胞浸潤顯著增加。Drp1抑制劑組病理損害有所改善。模型組腎小管損傷評分（Paller 評分）［（6.50±0.577）分］高于正常對照組［（1.25±0.500）分］和假手術組［（1.29±0.426）分］（P<0.05）；Drp1 抑制劑組腎小管損傷評分［（4.50±0.578）分］低于模型組［（6.50±0.577）分］（P<0.05）。

3.抑制Drp1 減輕腎臟組織細胞凋亡（每高倍鏡下綠色熒光陽性細胞數量）（圖3）

圖3 抑制Drp1減輕腎臟組織細胞凋亡。A為TUNEL法檢測大鼠腎臟組織細胞凋亡情況；B為每高倍鏡下綠色熒光陽性細胞數量

模型組每高倍鏡視野下大鼠腎組織細胞凋亡數量［（10.20±1.095）個］明顯高于正常對照組［（1.80±0.837）個］和假手術組［（2.40±0.547）個］（P<0.001）；Drp1 抑制劑組每高倍鏡視野下細胞凋亡數量［（6.60±1.140）個］低于模型組［（10.20±1.095）個］（P<0.05）。

4.電鏡觀察各組腎組織細胞線粒體結構（圖4）

圖4 透射電鏡觀察大鼠腎臟組織細胞線粒體結構（紅色箭頭標示線粒體位置）

與正常對照組和假手術組相比，模型組中線粒體結構出現明顯損傷，如線粒體空泡、腫脹、嵴斷裂等，而Drp1 抑制劑組線粒體的形態損傷減輕。

5.腎組織細胞線粒體ATP酶活力比較（圖5）

圖5 大鼠腎臟組織細胞線粒體ATP酶活力比較

腎組織細胞線粒體ATP 酶活力比較中，正常對照組［（6.49±0.120）U/mg prot］和假手術組［（6.38±0.321）U/mg prot］高于模型組［（4.18±0.198）U/mg prot］、Drp1 抑制劑組［（5.16±0.628）U/mg prot］，差異均有統計學意義（均P<0.05）；與模型組［（4.18±0.198）U/mg prot］比較，Drp1 抑制劑處理后明顯升高了ATP 酶活力［（5.16±0.628）U/mg prot］，差異均有統計學意義（均P<0.05）。

6.抑制Drp1降低細胞線粒體膜電位損傷（圖6）

圖6 抑制Drp1降低細胞線粒體膜電位損傷

線粒體功能有賴于線粒體膜電位的維持，線粒體膜電位下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件［8］。在體外建立HK-2細胞缺氧復氧模型中，Drp1抑制劑干預處理后得到的結果和體內腎組織細胞線粒體ATP 酶活力結果類似，與正常對照組和假手術組相比，模型組線粒體膜電位降低的細胞比例明顯增多，JC-1 標記的綠紅熒光比值最高，而Drp1抑制劑組較模型組降低（P<0.05）。

討 論

腎臟的耗氧量和線粒體含量僅次于心臟，是機體能量需求量最大的器官之一［13-15］。腎臟缺血再灌注后發生的線粒體功能障礙是促進AKI進一步發展的重要因素［10］。本研究結果表明，動物體內使用Mdivi-1 選擇性抑制Drp1 可以明顯減輕缺血再灌注引起的腎損傷，大鼠血清肌酐降低，腎小管損傷緩解，細胞凋亡減少，這與其抑制Drp1 保護線粒體結構，減輕線粒體膜電位損傷的作用有關。

線粒體的分裂、融合和自噬組成的動力學穩態是維系線粒體功能的基礎，線粒體的功能與其形態密切相關［8］。課題組前期研究發現，Drp1 磷酸化過程參與了缺血再灌注的腎損傷，本研究中，大鼠腎臟缺血再灌注的過程中選擇性抑制Drp1 保護了線粒體形態及功能，相較于模型組的血清肌酐水平最高，Drp1 抑制劑組的血清肌酐水平及電鏡下線粒體損傷程度明顯較模型組大鼠降低，這些表明在腎臟發生缺血再灌注的外在因素作用下，保持線粒體的形態及動力學的穩態減輕了腎臟的結構損傷［11］。在模擬體內缺血再灌注過程的缺氧復氧細胞模型中進一步證實了該點，即HK-2細胞在缺氧復氧后出現線粒體跨膜電位的損傷，而選擇性抑制Mdivi-1 后HK-2 細胞線粒體膜電位得以部分恢復。這些結果與在其他臟器如腦組織和心肌缺血再灌注損傷中觀察到的情形相似［16-17］。

Drp1 不僅是線粒體分裂的重要參與者，還參與了程序性細胞的死亡途徑，如caspase 依賴性凋亡和調控性壞死［18-19］。TUNEL 染色陽性細胞是典型的凋亡細胞，本研究中選擇性抑制Drp1 后大鼠的腎臟組織切片TUNEL 陽性染色的細胞明顯比模型組大鼠的要減少，這可能和其直接抑制Drp1 參與的程序性細胞凋亡有關。研究發現調控性壞死也參與了AKI 的過程，但調控性壞死的機制及途徑尚不十分清楚，目前認為在發生壞死的過程中，絲氨酸-蘇氨酸激酶被激活，導致混合譜系激酶域樣蛋白（MLKL）和磷酸甘油酸突變酶家族成員-5（PGAM5）被招募至線粒體表面并激活了Drp1，導致線粒體破碎和細胞死亡［19-20］。本研究中大鼠腎臟缺血再灌注過程中選擇性抑制Drp1 后，碎片化的線粒體數量明顯減少也可能和其減少調控性壞死的途徑有關。也有研究認為Drp1 和調控性壞死的相關性不強，缺血再灌注損傷過程中鈣超載和親環素D 介導了線粒體通透性轉變孔隙（mPTP）的開放，導致了線粒體的碎片化［21］。這些看似相反的觀點提示了腎臟缺血再灌注中線粒體損傷確切的機制仍有待進一步去研究。本實驗使用的選擇性Drp1 抑制劑Mdivi-1 在相關報道中有提示其會抑制電子呼吸鏈復合體1，從而可能會對實驗結果產生偏倚。

本研究結果說明了在腎臟發生缺血再灌注的過程中，選擇性抑制Drp1 蛋白可減輕線粒體膜電位損傷，保護線粒體的動力學結構穩態，改善能量代謝障礙，減少細胞凋亡，減輕腎缺血再灌注損傷。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明陳思奇：實施研究、采集數據、分析數據、起草文章；彭榮東、周曉瑩：實施研究及數據采集；徐嘉琪、馮俊霞：設計實驗及對文章內容評閱；張云芳：設計實驗、實驗指導、行政及材料支持；蘇妍妍：文章撰寫、對文章內容審閱、統計分析、獲取研究經費、指導