基于轉錄組的小豆SSR分子標記開發及其應用

徐曉丹, 冷 淼, 張明媛, 柯希望, 殷麗華, 左豫虎

(黑龍江省作物-有害生物互作生物學及生態防控重點實驗室，國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江八一農墾大學，黑龍江 大慶 163319)

小豆[Vignaangularis(Willd.) Ohwi & Ohashi]，俗名紅小豆、赤豆等，是一種重要的食用豆類作物，起源于我國，主要種植于中國、朝鮮和日本。近年來，小豆的種質資源鑒定和育種研究工作獲得了一定的成果，根據統計，1969—2019年，我國小豆育成品種共137份；然而與保存的超過5000份的小豆種質資源相較，我國的小豆種質資源尚未得到充分利用[1]。小豆育種工作相對滯后，究其原因是小豆基礎研究不足，特別是分子標記輔助育種的應用不夠深入，因此，加強小豆基礎研究，建立小豆DNA分子數據庫，挖掘其育種潛力，是當前深入推進小豆育種工作的一個有效途徑。

分子標記是鑒定種質資源和分子標記輔助育種的重要手段，而開發分子標記是小豆種質資源鑒定、創新和合理利用的第一步。在基于DNA的分子標記中，簡單重復序列(Simple Sequence Repeats, SSR)是一類由一定重復數目的重復單元(一般為1～6個堿基)組成的串聯重復序列，這種標記廣泛存在于動植物基因組中。相對于其他分子標記，SSR分子標記具有位點特異、復等位、共顯性和分布廣的優點，在許多作物的遺傳多樣性研究、品種鑒定、基因定位和分子標記輔助育種工作中應用廣泛[2-5]。然而，SSR分子標記在小豆研究上的應用較少，只在遺傳多樣性和基因定位方面有少量應用[6-11]。

SSR分子標記應用于小豆研究的前提是開發大量的小豆SSR分子標記。而利用轉錄組測序技術可以獲得大量序列信息用于分子標記開發。這一技術已經在糧食作物和經濟作物中得到成熟運用[12-14]，但在小豆及其近緣種作物上的應用卻較少。例如，Verma等[15]利用轉錄組序列在兵豆(LensculinarisMedik.)上開發了SSR分子標記，并利用開發的標記分析了兵豆種質資源的遺傳多樣性；Raizada等[16]通過轉錄組測序開發了黑吉豆(Vignamungovar. silvestris)的SSR分子標記。隨著高通量測序技術的發展和應用，小豆基因組已被破譯[17]，因此，利用轉錄組測序技術開發小豆SSR分子標記更具可行性。

本研究以小豆轉錄組測序技術為基礎，鑒定小豆轉錄組數據庫中的SSR分子標記，從而了解小豆轉錄組的SSR特性。在此基礎上，從開發的SSR分子標記中，選擇部分標記對小豆資源進行聚類分析，為小豆種質鑒定和資源合理利用奠定分子基礎。同時，也可為小豆分子標記輔助育種提供更豐富的標記來源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小豆種質資源36份，其中小豆種質‘QH1’用于轉錄組測序。所有小豆種質資源均保存于國家雜糧工程技術研究中心，來源信息詳見表1。

表1 供試小豆種質資源Table 1 Adzuki bean varieties for testing

1.2 轉錄組測序及SSR位點分析

在小豆資源‘QH1’單葉完全展開后，取葉片組織用于提取RNA，隨后進行轉錄組測序(北京諾禾致源科技股份有限公司)。對轉錄組測序獲得的Unigene進行過濾，去掉小片段。利用軟件Primer 3.0搜索過濾后序列的SSR位點，并根據搜索出的SSR位點及其側翼序列進行引物設計。

1.3 小豆基因組DNA提取

將用于小豆遺傳背景分析的種質材料種植在直徑18 cm的花盆中，當小豆植株單葉完全展開時取葉片組織。每個品種在5株植株上各取1片葉子用于提取小豆基因組DNA。DNA提取參照CTAB法，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測小豆基因組DNA的提取質量。

1.4 小豆SSR分子標記檢驗

為了檢驗開發的SSR分子標記的有效性，從小豆每條染色體上均勻隨機選取12個標記，總計132個SSR分子標記，合成引物。PCR反應體系為10 μL，DNA模板1 μL(80 ng)，上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，2×Taq PCRMasterMix 5 μl，補雙蒸水至總體積10 μL。PCR反應程序，95℃，預變性5 mins；95℃，變性30 s，57℃，退火30 s，72℃，復性45 s，35個循環；72℃，延伸10 mins。PCR產物與6×上樣緩沖液混合，利用DYCZ-30C雙板夾芯式垂直電泳儀(北京六一儀器廠)在8%變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，電泳后銀染顯影，拍照記錄帶型。

1.5 小豆種質資源的聚類分析

以36份小豆種質的DNA為模板，檢測多態性SSR標記的帶型。對聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果進行條帶統計，記錄每個位點的等位基因情況，記錄基因型。利用軟件Popgen 32和MEGA 7.0.14繪制進化樹，分析小豆種質資源的遺傳背景。

2 結果與分析

2.1 SSR分子標記類型特征及分布特點

轉錄組測序數據經過濾獲得37 362 760 bp數據，包括26 857個reads。SSR位點搜索，共檢測到3 045個SSR標記。SSR標記的重復單元堿基數1～6所對應的標記數目分別為1256、803、779、32、9和14個，另外，還有152個標記的重復單元為不同重復的組合(圖1,見17頁)。從不同重復單元的SSR標記數量分布可以看出，小豆轉錄組的SSR標記主要重復單元為1～3個堿基，包括41.2%的單核苷酸重復、26.4%的二核苷酸重復和25.6%的三核苷酸重復，三者占比93.2%。

圖1 不同重復單元的SSR標記的數量分布Fig.1 The number distribution of SSR markers with different repeat motif

將挖掘的3 045個SSR分子標記與小豆參考基因組(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_001723775.1)比對，1 986個標記(65.2%)可以錨定到小豆染色體上，這些錨定到染色體上的標記中，1 505個標記可成功設計引物。根據這1 505個標記的基因組位置信息，構建了包括1 505個SSR分子標記的小豆物理圖譜。

構建的物理圖譜的標記間平均物理距離為300 kb，各染色體上SSR分子標記的分布數量為56～244個，平均每條染色體分布標記數量為137個，其中，6號染色體標記數量最多，8號染色體標記分布數量最少。各染色體上的SSR標記數量分布雖然差別較大，但標記數量與染色體大小的變化曲線較為一致(圖2)，說明構建的SSR分子標記物理圖譜的標記分布較為均勻，各染色體上SSR標記數量的多少和染色體大小有關。

圖2 SSR標記在染色體上的分布Fig.2 Distribution of SSR markers on chromosomes

2.2 SSR標記的有效性檢驗

從構建的SSR分子標記的物理圖譜中，每條染色體隨機選取12個SSR分子標記，總計132個標記，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成標記的擴增引物。引物合成后，以小豆資源“QH1”的DNA為模板進行PCR擴增，擴增產物在8%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，發現共有118對引物可擴增出相應產物(圖3)，擴增產物大小為100～279 bp，引物擴增的有效率為89.4%。

圖3 132個SSR分子標記的有效性檢驗(數字為標記編號)Fig.3 Validity of 132 SSR molecular markers (number refers to the number of markers)

2.3 小豆種質資源的聚類分析

為了驗證開發的小豆SSR分子標記是否可以應用于小豆種質資源背景分析，經多態性篩選，獲得6個具有多態性的小豆SSR分子標記，包括標記ByauVa0261、ByauVa0277、ByauVa0300、ByauVa0303、ByauVa0451和ByauVa1454(表2)，可以用于小豆種質資源的遺傳背景分析。

表2 6個多態性SSR標記的引物Table 2 Primers for 6 polymorphic SSR markers

將6個多態性SSR分子標記在36份小豆品種上進行分型(圖4)，檢測到有效等位變異數為2～4個。利用軟件Popgen32，構建小豆種質資源的進化樹(圖5)，可以將供試小豆材料分為4組。Group 1包括13份小豆資源，其中，TL01、LZX066、QH5、LJ02、LJ03、GN01、GN02、紅豆 XD04-09、品紅23129-1和GN03共10份資源的分型結果完全一致，說明這些小豆資源的遺傳背景較為相近。Group 2包括18份小豆資源，其中，吉林373、保876-16、QH1、寶清紅和龍小豆2號分型一致，紅豆 XD04-07、TL04和QH4分型一致，TL03和TL05分型一致，其余小豆資源間均有一定的分型差異。Group 3有4份小豆資源，包括QH6、保876-16(2)、小豐2號和極旱紅小豆，資源間具有一定分型差異。Group 4包括1份小豆資源北6 JN003，該資源與其他資源遺傳差異較大。

圖4 6個SSR標記在36個小豆資源上的分型(左邊為標記名稱，紅色箭頭表示等位基因)Fig.4 Genotyping of six SSR markers on 36 adzuki bean varieties (label name on the left, alleles indicated by red arrows)

圖5 36份小豆資源的聚類分析圖Fig.5 Cluster analysis of 36 adzuki bean varieties

3 討 論

SSR分子標記在作物種質資源分析、基因定位等研究中應用較為廣泛。轉錄組測序比基因組測序成本低，因此許多植物通過轉錄組測序開發了大量SSR分子標記。在豇豆屬植物中，飯豆(VignaumbellataL.)、綠豆(VignaradiateL.)、黑豆[Vignamungo(L.) Hepper]以及小豆，都通過轉錄組測序開發了SSR分子標記[18-21]。Chen等[18]利用小豆轉錄組開發了7 947個SSR分子標記，其主要重復單元為單核苷酸、兩核苷酸和三核苷酸重復。本研究利小豆轉錄組測序數據開發了3 045個SSR分子標記，同樣發現，小豆轉錄組水平獲得的SSR分子標記的重復基序也為單核苷酸重復、二核苷酸重復和三核苷酸重復，分別占SSR標記總數的41.2%、26.4%和25.6%。此外，QH1是一個較優秀的小豆抗銹病資源，利用該資源的轉錄組測序開發的SSR分子標記可以用于該資源的抗銹病基因挖掘。

研究利用1 505個可以錨定至染色體上并且能夠設計引物的標記構建了較高密度的小豆SSR分子標記物理圖譜，豐富了小豆SSR分子標記數據庫。為了檢驗SSR分子標記的有效性，隨機從小豆的11條染色體上選擇132個SSR分子標記進行有效性檢驗，發現118個標記(89.4%)可以有效擴增出相應產物。這些標記將為小豆的種質資源鑒定、遺傳背景研究以及優良性狀基因定位提供技術支撐。經過多態性篩選，獲得6個多態性標記，利用其分析36份小豆種質資源的遺傳背景，可以將小豆資源分為4個類群，說明這16個標記可以用于小豆的資源鑒定。

小豆種質資源分析中發現，Group 1包括13份資源，10份來源于黑龍江省，3份來源于遼寧省，說明這一組的小豆資源以黑龍江省內小豆資源為主，與遼寧省的小豆資源有少量交流；Group 2包括18份資源，10份來源于黑龍江省，8份來源于遼寧省，說明這一組2個省份的小豆資源存在較廣泛的交流；Group 3的4份資源和Group 4的1份資源基因型較其他資源差異較大，說明這些資源的遺傳背景具有一定的獨特性。

聚類分析發現小豆種質存在基因型相同名稱不同的情況，Group 1中有10份品種，包括TL01、LZX066、QH5、LJ02、LJ03、GN01、GN02、紅豆 XD04-09、品紅23129-1和GN03，它們的分型結果一致；Group 2中，吉林373、保876-16、QH1、寶清紅和龍小豆2號分型一致，紅豆 XD04-07、TL04和QH4分型一致，“TL03”和“TL05”分型一致。這種結果出現的原因可能是多態性標記的數量較少，對于遺傳差異較小的種質，研究中使用的6個標記不足以完全區分。因此，有必要利用更多標記，加強小豆種質資源遺傳背景研究，梳理小豆種質資源情況，以加快小豆種質創建過程。